304 co-phàirt ceimigeach tubing coil stàilinn, Tha structar an ectodomain SPACA6 a’ toirt a-steach superteaghlach glèidhte de phròtainean co-cheangailte ri fusion gamete.

Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com.Tha thu a’ cleachdadh dreach brobhsair le taic CSS cuibhrichte.Airson an eòlas as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu brobhsair ùraichte (no cuir à comas Modh Co-chòrdalachd ann an Internet Explorer).A bharrachd air an sin, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, bidh sinn a 'sealltainn an làrach gun stoidhlichean agus JavaScript.
Sleamhnagan a’ sealltainn trì artaigilean gach sleamhnag.Cleachd na putanan air ais is air adhart gus gluasad tro na sleamhnagan, no na putanan rianadair sleamhnag aig an deireadh gus gluasad tro gach sleamhnag.

Tha SPACA6 na phròtain uachdar air a chuir an cèill le sperm a tha deatamach airson fusion gamete aig àm gintinn gnèitheasach mamail.A dh’aindeoin na dreuchd bhunaiteach seo, chan eilear a’ tuigsinn gnìomh sònraichte SPACA6.Bidh sinn a’ soilleireachadh structar criostail an àrainn extracellular de SPACA6 aig rùn 2.2 Å, a’ nochdadh pròtain dà-àrainn air a dhèanamh suas de phasgan ceithir-shreath agus ceapairean β coltach ri Ig còmhla ri luchd-ceangail leth-sùbailte.Tha an structar seo coltach ri IZUMO1, pròtain eile co-cheangailte ri fusion gamete, a’ dèanamh SPACA6 agus IZUMO1 mar bhuill stèidheachaidh den superteaghlach de phròtainean co-cheangailte ri todhar air an canar an seo mar an superfamily IST.Tha an superfamily IST air a mhìneachadh gu structarail leis a’ phasgan toinnte ceithir-helix aige agus paidhir de motifan CXXC ceangailte le disulfide.Chomharraich sgrùdadh AlphaFold stèidhichte air structar den proteome daonna buill pròtain a bharrachd den superfamily seo;gu sònraichte, tha mòran de na pròtanan sin an sàs ann an fusion gamete.Tha structar SPACA6 agus an dàimh a th’ aige ri buill eile de theaghlach IST a’ toirt seachad an ceangal a tha a dhìth nar n-eòlas air fusion gamete mamalan.
Bidh a h-uile beatha daonna a 'tòiseachadh le dà gametes haploid fa leth: sperm an athar agus ugh na màthar.Tha an sperm seo na bhuannaiche air pròiseas taghaidh dian far am bi milleanan de cheallan sperm a’ dol tro chùrsa ginealachd boireann, a’ faighinn thairis air diofar chnapan-starra1 agus a’ faighinn thairis air capacitation, a leasaicheas an gluasad agus am pròiseas de cho-phàirtean uachdar2,3,4.Fiù ma lorgar an sperm agus an oocyte a chèile, chan eil am pròiseas seachad fhathast.Tha an oocyte air a chuairteachadh le sreath de cheallan cumulus agus cnap-starra glycoprotein ris an canar an zona pellucida, tro am feum sperm a dhol a-steach don oocyte.Bidh spermatozoa a’ cleachdadh measgachadh de mholacilean adhesion uachdar agus einnseanan co-cheangailte ri membran agus dìomhair gus faighinn thairis air na cnapan-starra deireannach sin5.Tha na moileciuilean agus na h-enzyman sin air an stòradh sa mhòr-chuid anns an membran a-staigh agus matrix acrosomal agus lorgar iad nuair a tha membran a-muigh an sperm air a lìomhadh rè an ath-bhualadh acrosomal6.Is e an ceum mu dheireadh den turas dhian seo an tachartas fusion sperm-ugh, anns am bi an dà chealla a’ ceangal na buill-bodhaig aca gu bhith nan aon fhàs-bheairt diploid7.Ged a tha am pròiseas seo ùr-nodha ann an gintinn daonna, chan eilear a’ tuigsinn na h-eadar-obrachaidhean moileciuil a tha a dhìth.
A bharrachd air torrachadh gametes, chaidh sgrùdadh farsaing a dhèanamh air ceimigeachd measgachadh dà-thaobhach lipid.San fharsaingeachd, tha fusion membran na phròiseas lùthmhor mì-fhàbharach a dh ’fheumas catalyst pròtain a dhol tro atharrachadh co-chòrdalachd structarail a bheir dà membranes nas fhaisge air a chèile, a’ briseadh an leantalachd agus ag adhbhrachadh fusion8,9.Canar fusogens ris na catalysts pròtain seo agus chaidh an lorg ann an siostaman fusion gun àireamh.Tha feum orra airson a dhol a-steach do cheallan aoigheachd (me, gp160 ann an HIV-1, spìc ann an coronaviruses, hemagglutinin ann am bhìorasan influenza) 10,11,12 placental (syncytin)13,14,15 agus fusions cruthachadh gamete ann an eukaryotes nas ìsle ( HAP2/GCS1 ann an lusan, luchd-iomairt agus artrapod) 16,17,18,19.Cha deach fusogens airson gametes daonna a lorg fhathast, ged a chaidh grunn phròtainean a dhearbhadh gu bheil iad deatamach airson ceangal gamete agus fusion.B ’e an CD9 le oocyte-expressed, pròtain transmembrane a dh’ fheumar airson a bhith a ’cothlamadh gametes luchag is daonna, a’ chiad fhear a chaidh a lorg 21,22,23.Ged a tha an dearbh ghnìomh aige fhathast neo-shoilleir, tha coltas ann gu bheil àite ann an gèilleadh, structar fòcas adhesion air microvilli ugh, agus / no suidheachadh ceart de phròtainean uachdar oocyte 24,25,26.Is e an dà phròtain as àbhaistiche a tha deatamach airson fusion gamete am pròtain sperm IZUMO127 agus am pròtain oocyte JUNO28, agus tha an ceangal aca mar cheum cudromach ann an aithneachadh gamete agus gèilleadh mus tèid iad còmhla.Tha luchagan bualadh fireann Izumo1 agus luchagan cnagadh boireann Juno gu tur sterile, anns na modailean sin bidh sperm a’ dol a-steach don àite perivitelline ach cha bhith gametes a’ leaghadh.San aon dòigh, chaidh comar a lughdachadh nuair a chaidh gametes a làimhseachadh le antibodies anti-IZUMO1 no JUNO27,29 ann an deuchainnean torrachadh in vitro daonna.
O chionn ghoirid, chaidh buidheann de phròtainean a chaidh an cur an cèill le sperm a lorg a tha gu h-iongantach coltach ri IZUMO1 agus JUNO20,30,31,32,33,34,35.Tha pròtain co-cheangailte ri membran acrosomal 6 (SPACA6) air a chomharrachadh mar riatanach airson torrachadh ann an sgrùdadh mòr-sgèile mutagenesis murine.Le bhith a’ cur a-steach an transgene a-steach don ghine Spaca6 a’ toirt a-mach spermatozoa nach gabh fhuasgladh, ged a tha na spermatozoa sin a’ in-shìoladh a-steach don àite perivitelline 36 .Dhearbh sgrùdaidhean às deidh sin ann an luchagan gu bheil feum air Spaca6 airson fusion gamete 30,32 .Tha SPACA6 air a chuir an cèill cha mhòr a-mhàin anns na testes agus tha pàtran ionadail coltach ris an fhear aig IZUMO1, is e sin taobh a-staigh intima an spermatozoa ron ath-bhualadh acrosomal, agus an uairsin imrich chun roinn crios-meadhain às deidh an ath-bhualadh acrosomal 30,32.Tha homologues Spaca6 ann am measgachadh de mhamalan agus eukaryotes eile 30 agus tha cho cudromach sa tha e airson fusion gamete daonna air a nochdadh le bhith a’ cuir casg air todhar daonna in vitro le bhith a’ cur an aghaidh SPACA6 30 .Eu-coltach ri IZUMO1 agus JUNO, tha mion-fhiosrachadh mu structar, eadar-obrachadh agus gnìomh SPACA6 fhathast neo-shoilleir.
Gus tuigse nas fheàrr fhaighinn air a’ phròiseas bhunaiteach a tha mar bhunait ri cothlamadh sperm daonna agus uighean, a leigeas leinn fiosrachadh a thoirt do leasachaidhean san àm ri teachd ann am planadh teaghlaich agus làimhseachadh torachais, rinn sinn sgrùdaidhean structarail agus bith-cheimiceach SPACA6.Tha structar criostail an àrainn extracellular de SPACA6 a 'sealltainn pasgan ceithir-helical (4HB) agus àrainn coltach ri immunoglobulin (coltach ri Ig) ceangailte le roinnean leth-sùbailte.Mar a bha dùil ann an sgrùdaidhean roimhe, 7,32,37 tha structar fearainn SPACA6 coltach ri structar IZUMO1 daonna, agus tha motif neo-àbhaisteach aig an dà phròtain: 4HB le uachdar helical triantanach agus paidhir de motifan CXXC ceangailte ri disulfide.Tha sinn a’ moladh gum bi IZUMO1 agus SPACA6 a-nis a’ mìneachadh superfamily nas motha, le structar structarail de phròtainean co-cheangailte ri fusion gamete.A’ cleachdadh feartan gun samhail don superfamily, rinn sinn sgrùdadh coileanta airson proteome daonna structarail AlphaFold, a’ comharrachadh buill a bharrachd den superfamily seo, a’ toirt a-steach grunn bhuill a bha an sàs ann an fusion gamete agus / no torrachadh.Tha e coltach a-nis gu bheil filleadh structarail cumanta agus superteaghlach de phròtainean co-cheangailte ri fusion gamete, agus tha an structar againn a’ toirt seachad mapa moileciuil den taobh chudromach seo de uidheamachd fusion gamete daonna.
Tha SPACA6 na phròtain transmembrane aon-bhealaich le aon glycan ceangailte le N agus sia bannan disulfide putative (Figearan S1a agus S2).Chuir sinn an cèill an raon extracellular de SPACA6 daonna (fuigheall 27-246) ann an ceallan Drosophila S2 agus ghlan sinn am pròtain a’ cleachdadh dàimh nicil, iomlaid cation, agus cromatagrafaidheachd às-dùnadh meud (Fig. S1b).Tha an ectodomain SPACA6 puraichte gu math seasmhach agus aon-ghnèitheach.Nochd mion-sgrùdadh a’ cleachdadh cromatagrafaidheachd às-dùnadh meud còmhla ri sgapadh solais ioma-thaobhach (SEC-MALS) aon stùc le cuideam moileciuil air a thomhas de 26.2 ± 0.5 kDa (Fig. S1c).Tha seo co-chòrdail ri meud an ectodomain monomeric SPACA6, a 'sealltainn nach do thachair oligomerization aig àm glanadh.A bharrachd air an sin, nochd speactroscopaidh dichroism cruinn (CD) structar measgaichte α/β le puing leaghaidh de 51.3 °C (Fig. S1d,e).Nochd sgaoileadh an speactram CD 38.6% α-helical agus 15.8% β-shreath eileamaidean (Figear S1d).
Chaidh an ectodomain SPACA6 a chriostalachadh le bhith a’ cleachdadh sìolachadh matrix air thuaiream38 a’ leantainn gu seata dàta le rùn de 2.2 Å (Clàr 1 agus Figear S3).A’ cleachdadh measgachadh de ionadachadh moileciuil stèidhichte air criomag agus dàta ceumnachaidh SAD le foillseachadh bromide airson co-dhùnadh structar (Clàr 1 agus Figear S4), tha am modail ath-leasaichte mu dheireadh a’ toirt a-steach fuigheall 27–246.Aig an àm a chaidh an structar a dhearbhadh, cha robh structaran deuchainneach no AlphaFold rim faighinn.Tha an ectodomain SPACA6 a’ tomhas 20 Å × 20 Å × 85 Å, air a dhèanamh suas de sheachd helices agus naoi dualan β, agus tha filleadh treas-ìre fada air a dhèanamh seasmhach le sia bannan disulfide (Fig. 1a, b).Tha an dùmhlachd dealanach lag aig deireadh slabhraidh taobh Asn243 a’ nochdadh gur e glycosylation ceangailte ri N a th’ anns an fhuigheall seo.Tha an structar air a dhèanamh suas de dhà raon: pasgan ceithir-helix N-terminal (4HB) agus fearann ​​​​coltach ri C-terminal Ig le roinn lùdag eadar-mheadhanach eatorra (Fig. 1c).
Structar de dh'àrainn extracellular SPACA6.Diagram stiall de raon extracellular SPACA6, dath an t-seine bho N gu C-terminus bho ghorm dorcha gu dearg dorcha.Tha cysteines a tha an sàs ann an ceanglaichean disulfide air an comharrachadh ann am magenta.b Topology an àrainn extracellular de SPACA6.Cleachd an aon sgeama dathan agus a tha ann am Figear 1a.c SPACA6 àrainn extracellular.Tha na clàran stiallan fearainn coltach ri 4HB, lùdag, agus Ig air an dath orains, uaine is gorm, fa leth.Chan eil na sreathan air an tarraing gu sgèile.
Tha raon 4HB de SPACA6 a’ toirt a-steach ceithir prìomh helices (helices 1-4), a tha air an rèiteachadh ann an cruth helix helical (Fig. 2a), a’ dol mu seach eadar eadar-obrachaidhean antiparallel agus co-shìnte (Fig. 2b).Tha helix beag aon-tionndaidh a bharrachd (helix 1 ′) air a chuir sìos ceart-cheàrnach ris a’ phasgan, a’ cruthachadh triantan le helices 1 agus 2. Tha an triantan seo beagan deformed ann am pacadh helical-toisich a’ phacaid a tha an ìre mhath dùmhail de helices 3 agus 4 ( Fig. 2a).
Clàr stiall N-terminal 4HB.b Sealladh àrd de phasgan de cheithir helices, gach helix air a chomharrachadh ann an gorm dorcha aig an N-terminus agus dorcha dearg aig an C-terminus.c Diagram cuibhle shnìomhanach bho mhullach gu bonn airson 4HB, le gach fuigheall air a shealltainn mar chearcall air a chomharrachadh le còd aminoideach aon-litir;chan eil ach na ceithir amino-aigéid aig mullach na cuibhle air an àireamhachadh.Tha fuigheall neo-polar air an dath buidhe, tha fuigheall pòlach gun phàigheadh ​​​​air an dath uaine, tha fuigheall le deagh chasaid air an dath gorm, agus tha fuigheall le droch chasaid air an dath dearg.d Aghaidhean triantanach ann an raon 4HB, le 4HBan ann an orains agus lùdagan ann an uaine.Tha an dà inset a’ nochdadh ceanglaichean disulfide ann an cumadh slat.
Tha 4HB stèidhichte air cridhe hydrophobic a-staigh air a dhèanamh suas sa mhòr-chuid de fhuigheall aliphatic agus cùbhraidh (Fig. 2c).Anns a’ chridhe tha ceangal disulfide eadar Cys41 agus Cys55 a tha a’ ceangal helices 1 agus 2 ri chèile ann an triantan àrdaichte (Fig. 2d).Chaidh dà cheangal disulfide a bharrachd a chruthachadh eadar an motif CXXC ann an Helix 1′ agus motif CXXC eile a chaidh a lorg aig bàrr an β-hairpin ann an roinn na hinge (Fig. 2d).Tha fuigheall arginine glèidhteach le gnìomh neo-aithnichte (Arg37) suidhichte taobh a-staigh triantan lag air a chruthachadh le helices 1 ′, 1, agus 2. Bidh atoman gualain alafataigeach Cβ, Cγ, agus Cδ Arg37 ag eadar-obrachadh leis a 'chridhe hydrophobic, agus bidh na buidhnean guanidine a' gluasad gu rothachail eadar helices 1′ agus 1 tro eadar-obrachadh eadar cnàimh-droma Thr32 agus slabhraidh taobh (Fig. S5a,b).Tha Tyr34 a’ leudachadh a-steach don chuas a’ fàgail dà chuas bheag tro am faod Arg37 eadar-obrachadh leis an t-solusach.
Tha raointean β-ceapaire coltach ri Ig nan sàr-theaghlach de phròtainean a tha a’ co-roinn an fheart cumanta de dhà no barrachd dhuilleagan β amphipathic ioma-shreath ag eadar-obrachadh tro chridhe hydrophobic 39. Tha an aon phàtran aig an àrainn C-terminal Ig-like de SPACA6. agus tha dà shreath ann (Fig. S6a).Tha duilleag 1 na β-duilleig de cheithir iallan (iallan D, F, H, agus I) far a bheil dualan F, H, agus I a’ dèanamh rèiteachadh an-aghaidh co-shìnte, agus bidh dualan I agus D a’ gabhail ri eadar-obrachadh co-shìnte.Tha Clàr 2 na dhuilleag beta le sreathan dùbailte an-aghaidh co-shìnte (iallan E agus G).Chaidh ceangal disulfide a-staigh a choimhead eadar ceann-uidhe C na slabhraidh E agus meadhan na slabhraidh H (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Tha an ceangal disulfide seo co-chosmhail ris a’ cheangal disulfide anns an raon β-ceapaire de immunoglobulin40,41.
Bidh an duilleag β ceithir-iath a’ tionndadh air an fhad gu lèir, a’ cruthachadh oirean neo-chunbhalach a tha eadar-dhealaichte ann an cumadh agus electrostatics.Tha an oir nas taine na uachdar àrainneachdail hydrophobic còmhnard a tha a’ seasamh a-mach an taca ris na h-uachdaran neo-chòmhnard agus eadar-mheasgte gu dealanach ann an SPACA6 (Fig. S6b,c).Tha lòchran de bhuidhnean carbonyl/amino cnàimh-droma fosgailte agus slabhraidhean taobh pòla a' cuairteachadh an uachdar hydrophobic (Fig. S6c).Tha an iomall nas fharsainge air a chòmhdach le earrann helical le mullach a tha a 'blocadh a' chuibhreann N-terminal den chridhe hydrophobic agus a 'cruthachadh trì bannan hydrogen le buidheann pòlach fosgailte cnàimh-droma slabhraidh F (Fig. S6d).Tha am pàirt C-terminal den oir seo na phòcaid mhòr le cridhe hydrophobic a tha fosgailte gu ìre.Tha am pòcaid air a chuairteachadh le cosgaisean dearbhach mar thoradh air trì seataichean de dh’ fuigheall arginine dùbailte (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 agus Arg212-Arg214) agus histidine sa mheadhan (His220) (Figear S6e).
Tha an roinn lùdag na earrann ghoirid eadar an raon helical agus an raon coltach ri Ig, air a dhèanamh suas de aon β-fhilleadh trì-shreath antiparallel (iallan A, B agus C), helix beag 310, agus grunn earrannan helical fada air thuaiream.(Fig. S7).Tha e coltach gu bheil lìonra de luchd-ceangail covalent agus electrostatach anns an roinn lùdag a’ bunailteachadh an stiùireadh eadar 4HB agus an raon coltach ri Ig.Faodar an lìonra a roinn ann an trì pàirtean.Tha a’ chiad phàirt a’ toirt a-steach dà motif CXXC (27CXXC30 agus 139CXXC142) a tha a’ cruthachadh paidhir de cheanglaichean disulfide eadar an β-hairpin anns a’ lùdag agus an 1 ′ helix ann an 4HB.Tha an dàrna pàirt a’ toirt a-steach eadar-obrachadh electrostatach eadar an raon coltach ri Ig agus an lùdag.Tha Glu132 anns an lùdag a’ cruthachadh drochaid shalainn le Arg233 anns an raon coltach ri Ig agus Arg135 anns a’ lùdag.Tha an treas pàirt a’ toirt a-steach ceangal covalent eadar an àrainn coltach ri Ig agus an roinn lùdagach.Bidh dà cheangal disulfide (Cys124-Cys147 agus Cys128-Cys153) a’ ceangal an lùb lùdagach ri ceanglaiche a tha air a dhèanamh seasmhach le eadar-obrachadh electrostatach eadar Gln131 agus a’ bhuidheann gnìomh cnàimh-droma, a’ toirt cothrom air a’ chiad raon coltach ri Ig.slabhraidh.
Chaidh structar an ectodomain SPACA6 agus structaran fa leth de raointean coltach ri 4HB agus Ig a chleachdadh gus clàran structarail coltach ri chèile a lorg ann an stòran-dàta pròtain 42 .Chomharraich sinn maidsean le sgòran àrda Dali Z, claonaidhean àbhaisteach beaga, agus sgòran mòra LALI (am fear mu dheireadh an àireamh de dh’ fhuigheall structarail).Fhad ‘s a bha sgòr Z iomchaidh de> 842 aig a’ chiad 10 buillean bhon làn sgrùdadh ectodomain (Clàr S1), sheall sgrùdadh airson àrainn 4HB no Ig a-mhàin gu robh a’ mhòr-chuid de na buillean sin a’ freagairt ri β-ceapaire a-mhàin.filleadh uile-làthaireach a lorgar ann am mòran phròtainean.Cha do thill na trì rannsachaidhean ann an Dali ach aon toradh: IZUMO1.
Chaidh a mholadh o chionn fhada gu bheil SPACA6 agus IZUMO1 a’ roinn rudan coltach ri structar7,32,37.Ged nach eil ectodomains an dà phròtain seo a tha co-cheangailte ri fusion gamete a’ roinn ach dearbh-aithne sreath 21% (Figear S8a), leig fianais iom-fhillte, a’ toirt a-steach pàtran bannan disulfide glèidhte agus àrainn coltach ri C-terminal Ig ann an SPACA6, oidhirpean tràth air togail modal homology de luchag A a SPACA6 a’ cleachdadh IZUMO1 mar theamplaid37.Tha an structar againn a’ dearbhadh na ro-innse sin agus a’ sealltainn an fhìor ìre de choltas.Gu dearbh, tha na structaran SPACA6 agus IZUMO137,43,44 a 'co-roinn an aon ailtireachd dà-àrainn (Fig. S8b) le raointean β-ceapaire coltach ri 4HB agus Ig ceangailte le roinn lùbach (Fig. S8c).
Tha eadar-dhealachaidhean cumanta aig IZUMO1 agus SPACA6 4HB bho phasganan snìomhach àbhaisteach.Tha 4HBn àbhaisteach, mar an fheadhainn a chaidh a lorg ann an iom-fhilltean pròtain SNARE a tha an sàs ann an fusion endosomal 45,46, air helices air an cuairteachadh gu cothromach a’ cumail suas curvature seasmhach timcheall air axis mheadhanach 47. An coimeas ri sin, chaidh na raointean helical anns an dà chuid IZUMO1 agus SPACA6 a shaobhadh, le curvature caochlaideach agus pacadh neo-chòmhnard (Figear S8d).Tha an toinneamh, is dòcha air adhbhrachadh leis an triantan a chaidh a chruthachadh le helices 1′, 1 agus 2, air a chumail ann an IZUMO1 agus SPACA6 agus air a dhèanamh seasmhach leis an aon motif CXXC air helix 1′.Ach, tha an ceangal disulfide a bharrachd a chaidh a lorg ann an SPACA6 (Cys41 agus Cys55 a 'ceangal helices 1 agus 2 gu h-àrd) a' cruthachadh apex nas gèire aig apex an triantain, a 'dèanamh SPACA6 nas toinnte na IZUMO1, le triantanan caise nas fhollaisiche.A bharrachd air an sin, tha dìth Arg37 aig IZUMO1 a chaidh fhaicinn ann am meadhan a’ chuan seo ann an SPACA6.An coimeas ri sin, tha cridhe hydrophobic nas àbhaistich aig IZUMO1 de fhuigheall aliphatic agus cùbhraidh.
Tha raon coltach ri Ig aig IZUMO1 anns a bheil duilleag β le dà shreath agus còig sreathan43.Bidh an iallan a bharrachd ann an IZUMO1 a’ dol an àite a’ choil ann an SPACA6, a bhios ag eadar-obrachadh leis an iallan F gus bannan hydrogen cnàimh-droma a chuingealachadh san iallan.Is e puing coimeas inntinneach an cosgais uachdar ris a bheil dùil de raointean coltach ri Ig den dà phròtain.Tha an uachdar IZUMO1 nas àicheil na uachdar SPACA6.Tha cosgais a bharrachd faisg air ceann-uidhe C mu choinneimh an membran sperm.Ann an SPACA6, bha na h-aon roinnean nas neo-phàirteach no fo chasaidean dearbhach (Fig. S8e).Mar eisimpleir, tha an uachdar hydrophobic (oirean nas taine) agus slocan le deagh chasaid (oirean nas fharsainge) ann an SPACA6 fo chasaid àicheil ann an IZUMO1.
Ged a tha an dàimh agus na h-eileamaidean structar àrd-sgoile eadar IZUMO1 agus SPACA6 air an deagh ghleidheadh, sheall co-thaobhadh structarail nan raointean coltach ri Ig gu bheil an dà raon eadar-dhealaichte a thaobh an stiùireadh coitcheann an coimeas ri chèile (Fig. S9).Tha am pasgan snìomhach de IZUMO1 lùbte mun β-cheapaire, a’ cruthachadh an cumadh “boomerang” a chaidh a mhìneachadh roimhe seo aig mu 50 ° bhon axis mheadhanach.An coimeas ri sin, chaidh an giùlan helical ann an SPACA6 a chlaonadh mu 10 ° an taobh eile.Tha e coltach gu bheil na h-eadar-dhealachaidhean anns na stiùiridhean sin mar thoradh air eadar-dhealachaidhean ann an roinn na hinge.Aig ìre an t-sreath bun-sgoile, tha IZUMO1 agus SPACA6 a’ roinn glè bheag de choltas sreath aig a’ lùdag, ach a-mhàin fuigheall cysteine, glycine, agus searbhag aspartic.Mar thoradh air an sin, tha bannan hydrogen agus lìonraidhean electrostatach gu tur eadar-dhealaichte.Tha eileamaidean structar àrd-sgoile β-duilleag air an roinn le IZUMO1 agus SPACA6, ged a tha na slabhraidhean ann an IZUMO1 fada nas fhaide agus tha an 310 helix (helix 5) gun samhail dha SPACA6.Tha na h-eadar-dhealachaidhean sin a’ leantainn gu diofar stiùiridhean fearainn airson dà phròtain a tha coltach ri chèile.
Nochd an sgrùdadh frithealaiche Dali againn gur e SPACA6 agus IZUMO1 an aon dà structar a chaidh a dhearbhadh gu deuchainneach a tha air an stòradh anns an stòr-dàta pròtain aig a bheil am pasgan 4HB sònraichte seo (Clàr S1).O chionn ghoirid, tha DeepMind (Aibidil / Google) air AlphaFold a leasachadh, siostam stèidhichte air lìonra neural a bhios comasach air ro-innse ceart a dhèanamh air structaran 3D de phròtainean bho phrìomh shreathan48.Goirid às deidh dhuinn structar SPACA6 fhuasgladh, chaidh stòr-dàta AlphaFold a leigeil ma sgaoil, a ’toirt seachad modalan structar ro-innse a’ còmhdach 98.5% de na pròtanan gu lèir ann am proteome daonna48,49.Le bhith a’ cleachdadh an structair SPACA6 fuasglaidh againn mar mhodail sgrùdaidh, chomharraich sgrùdadh homology structarail airson a’ mhodail ann am proteome daonna AlphaFold tagraichean le coltas structarail a dh’ fhaodadh a bhith aca ri SPACA6 agus IZUMO1.Leis cho neo-chinnteach 'sa tha AlphaFold ann a bhith a' ro-innse SPACA6 (Fig. S10a) - gu h-àraidh an ectodomain 1.1 Å rms an taca ris an structar fuasglaidh againn (Fig. S10b) - faodaidh sinn a bhith misneachail gu bheil na maidsean SPACA6 ainmichte dualtach a bhith ceart.
Roimhe sin, rannsaich PSI-BLAST an cruinneachadh IZUMO1 le trì pròtanan eile co-cheangailte ri sperm: IZUMO2, IZUMO3, agus IZUMO450.Bha AlphaFold an dùil gum biodh na pròtanan teaghlaich IZUMO seo a’ pasgadh a-steach don raon 4HB leis an aon phàtran bannan disulfide ri IZUMO1 (Figearan 3a agus S11), ged nach eil àrainn coltach ri Ig aca.Thathas den bheachd gu bheil IZUMO2 agus IZUMO3 nam pròtanan membran aon-thaobhach coltach ri IZUMO1, fhad ‘s a tha coltas gu bheil IZUMO4 dìomhair.Cha deach gnìomhan pròtainean IZUMO 2, 3, agus 4 ann an fusion gamete a dhearbhadh.Tha fios gu bheil pàirt aig IZUMO3 ann am biogenesis acrosome rè leasachadh sperm51 agus chaidh lorg gu bheil am pròtain IZUMO a’ cruthachadh iom-fhillte50.Tha glèidhteachas phròtainean IZUMO ann am mamalan, snàgairean, agus muir-thìrich a’ moladh gu bheil an gnìomh a dh’ fhaodadh a bhith aca co-chòrdail ri gnìomh pròtainean eile a tha co-cheangailte ri gamete-fusion, leithid DCST1/2, SOF1, agus FIMP.
Diagram de dh'ailtireachd àrainn an teaghlaich IST, le raointean 4HB, lùdag, agus Ig air an comharrachadh ann an orains, uaine is gorm, fa leth.Tha roinn sònraichte C-terminal aig IZUMO4 a tha a’ coimhead dubh.Tha bannan disulfide dearbhte agus putative air an sealltainn le loidhnichean cruaidh agus dotagach, fa leth.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F15), DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) air an taisbeanadh anns an aon raon dath ri pannal A. Tha bannan disulfide air an sealltainn ann am magenta.Chan eil helices transmembrane TMEM95, IZUMO2 agus IZUMO3 air an sealltainn.
Eu-coltach ri pròtain IZUMO, thathas a 'smaoineachadh gu bheil pròtanan SPACA eile (ie, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, agus SPACA9) eadar-dhealaichte bho structar SPACA6 (Fig. S12).Chan eil ach SPACA9 aig a bheil 4HB, ach chan eilear an dùil gum bi an aon stiùireadh co-shìnte-an-aghaidh co-shìnte aige no an aon cheangal disulfide ri SPACA6.Chan eil ach SPACA1 aig a bheil àrainn coltach ri Ig.Tha AlphaFold a’ dèanamh a-mach gu bheil structar gu tur eadar-dhealaichte aig SPACA3, SPACA4 agus SPACA5 na SPACA6.Gu inntinneach, tha fios cuideachd gu bheil pàirt aig SPACA4 ann an torrachadh, ach gu ìre nas motha na SPACA6, an àite sin a’ comasachadh an eadar-obrachadh eadar sperm agus oocyte zona pellucida52.
Lorg an rannsachadh AlphaFold againn maids eile airson IZUMO1 agus SPACA6 4HB, TMEM95.Tha TMEM95, aon phròtain transmembrane sònraichte a tha sònraichte do sperm, a’ fàgail luchainn fireann neo-thorrach nuair a dh’ fhàsas iad 32,33.Bha morf-eòlas àbhaisteach aig spermatozoa le dìth TMEM95, motility, agus an comas a dhol a-steach don zona pellucida agus ceangal ris an membran ugh, ach cha b’ urrainn dha a dhol còmhla ris an membran oocyte.Tha sgrùdaidhean roimhe air sealltainn gu bheil TMEM95 a’ roinn rudan coltach ri structar le IZUMO133.Gu dearbha, dhearbh modal AlphaFold gur e 4HB a th’ ann an TMEM95 leis an aon phaidhir de motifan CXXC ri IZUMO1 agus SPACA6 agus an aon cheangal disulfide a bharrachd eadar helices 1 agus 2 a lorgar ann an SPACA6 (Fig. 3a agus S11).Ged nach eil àrainn coltach ri Ig aig TMEM95, tha roinn ann le pàtran ceangail disulfide coltach ri roinnean lùdachaidh SPACA6 agus IZUMO1 (Fig. 3b).Aig àm foillseachaidh an làmh-sgrìobhainn seo, thug am frithealaiche ro-chlò-bhualadh cunntas air structar TMEM95, a’ dearbhadh toradh AlphaFold53.Tha TMEM95 glè choltach ri SPACA6 agus IZUMO1 agus tha e air a ghleidheadh ​​​​gu mean air mhean ann am muir-thìrich (Fig. 4 agus S13).
Chleachd an rannsachadh PSI-BLAST stòran-dàta NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, agus SOF1 gus suidheachadh nan sreathan sin ann an craobh na beatha a dhearbhadh.Chan eil astar eadar puingean meòir air a shealltainn a rèir sgèile.
Tha an coltas structarail iomlan iongantach eadar SPACA6 agus IZUMO1 a’ nochdadh gu bheil iad nam buill stèidheachaidh de shàr-theaghlach structarail glèidhte a tha a’ toirt a-steach pròtanan TMEM95 agus IZUMO 2, 3, agus 4.buill aithnichte: IZUMO1, SPACA6 agus TMEM95.Leis nach eil ach beagan bhall aig a bheil raointean coltach ri Ig, is e comharradh an t-suirbhidh IST an àrainn 4HB, aig a bheil feartan sònraichte a tha cumanta dha na pròtanan sin uile: 1) Coiled 4HB le helices air an rèiteachadh ann an atharrachadh an-aghaidh co-shìnte / co-shìnte (Fig 5a), 2) tha aghaidh triantanach air a’ phasgan anns a bheil dà helices taobh a-staigh a’ phasgan agus an treas helix dìreach (Fig. prìomh raon (Fig. 5c). mar sensor redox 54,55,56 , fhad ‘s a dh’ fhaodadh am motif ann am buill teaghlaich IST a bhith co-cheangailte ri isomerases disulfide pròtain leithid ERp57 ann an fusion gamete.
Tha buill den superfamily IST air am mìneachadh le trì feartan sònraichte de raon 4HB: ceithir helices ag atharrachadh eadar stiùireadh co-shìnte agus antiparallel, aghaidhean bundle helical ba-triantanach, agus motif dùbailte ca CXXC air a chruthachadh eadar moileciuilean beaga.) Helixes N-terminal (orains) agus roinn lùbach β-hairpin (uaine).
Leis gu bheil e coltach eadar SPACA6 agus IZUMO1, chaidh deuchainn a dhèanamh air comas a’ chiad fhear ceangal ri IZUMO1 no JUNO.Tha biolayer interferometry (BLI) na dhòigh ceangail stèidhichte air cinneasach a chaidh a chleachdadh roimhe seo gus an eadar-obrachadh eadar IZUMO1 agus JUNO a thomhas.Às deidh an sensor le bileagan biotin a thoirt a-steach le IZUMO1 mar bhiathadh le dùmhlachd àrd de mhion-sgrùdadh JUNO, chaidh comharra làidir a lorg (Fig. S14a), a ’nochdadh atharrachadh ceangailteach ann an tiugh a’ bhith-stuth ceangailte ri tip an sensor.Comharran co-chosmhail (ie, JUNO ceangailte ris an sensor mar bhiathadh an aghaidh IZUMO1 analyte) (Fig. S14b).Cha deach comharra sam bith a lorg nuair a chaidh SPACA6 a chleachdadh mar mhion-sgrùdadh an aghaidh IZUMO1 ceangailte le sensor no JUNO ceangailte le sensor (Figear S14a,b).Tha dìth a ’chomharra seo a’ nochdadh nach eil an raon extracellular de SPACA6 ag eadar-obrachadh leis an raon extracellular de IZUMO1 no JUNO.
Leis gu bheil an assay BLI stèidhichte air biotinylation de fhuigheall lysine an-asgaidh air a’ phròtain biathadh, faodaidh an t-atharrachadh seo casg a chuir air ceangal ma tha fuigheall lysine an sàs san eadar-obrachadh.A bharrachd air an sin, faodaidh stiùireadh an ceangail an coimeas ris an sensor cnapan-starra làidir a chruthachadh, agus mar sin chaidh measaidhean slaodadh sìos àbhaisteach a dhèanamh cuideachd air na SPACA6, IZUMO1 agus JUNO ectodomains ath-leasaichte.A dh'aindeoin seo, cha do dh'èirich SPACA6 le His-tagged IZUMO1 no His-tagged JUNO (Fig. S14c,d), a' comharrachadh nach robh eadar-obrachadh sam bith co-chòrdail ris an fheadhainn a chaidh fhaicinn ann an deuchainnean BLI.Mar smachd adhartach, dhearbh sinn eadar-obrachadh JUNO leis an ainm His IZUMO1 (Figearan S14e agus S15).
A dh’ aindeoin cho coltach ‘s a tha structarail eadar SPACA6 agus IZUMO1, chan eil e na iongnadh neo-chomas SPACA6 JUNO a cheangal.Tha còrr air 20 fuigheall aig uachdar IZUMO1 daonna a tha ag eadar-obrachadh le JUNO, a’ toirt a-steach fuigheall bho gach aon de na trì roinnean (ged a tha a’ mhòr-chuid dhiubh suidhichte ann an roinn na hinge) (Fig. S14f).De na fuigheall sin, chan eil ach aon air a ghleidheadh ​​ann an SPACA6 (Glu70).Ged a ghlèidh mòran de luchd-ionaid fuigheall na feartan bith-cheimiceach tùsail aca, chaidh an Asp148 le cosgais àicheil ann an SPACA6 a chuir an àite fuigheall riatanach Arg160 ann an IZUMO1;tha sgrùdaidhean roimhe air sealltainn gu bheil am mùthadh Arg160Glu ann an IZUMO1 cha mhòr gu tur a’ cur às do cheangal ri JUNO43.A bharrachd air an sin, mheudaich an eadar-dhealachadh ann an stiùireadh fearainn eadar IZUMO1 agus SPACA6 gu mòr farsaingeachd uachdar làrach ceangail JUNO den roinn cho-ionann air SPACA6 (Fig. S14g).
A dh'aindeoin an fheum aithnichte airson SPACA6 airson gamete fusion agus cho coltach ri IZUMO1, chan eil coltas gu bheil gnìomh ceangail JUNO co-ionann aig SPACA6.Mar sin, tha sinn air feuchainn ris an dàta structarail againn a chur còmhla ri fianais de chudromachd air a thoirt seachad le bith-eòlas mean-fhàs.Tha co-thaobhadh sreath de homologues SPACA6 a’ sealltainn glèidhteachas an structair chumanta taobh a-muigh mamalan.Mar eisimpleir, tha fuigheall cysteine ​​an làthair eadhon ann am muir-thìrich a tha fada air falbh (Fig. 6a).A’ cleachdadh an t-seirbheisiche ConSurf, chaidh dàta gleidhidh co-thaobhadh ioma-sreath de shreathan 66 a mhapadh gu uachdar SPACA6.Faodaidh an seòrsa anailis seo sealltainn dè na fuigheall a chaidh a ghleidheadh ​​​​rè mean-fhàs pròtain agus faodaidh e innse dè na roinnean uachdar aig a bheil pàirt ann an gnìomh.
a Co-thaobhadh sreath de ectodomains SPACA6 bho 12 gnè eadar-dhealaichte air an ullachadh a’ cleachdadh CLUSTAL OMEGA.A rèir anailis ConSurf, tha na dreuchdan as gleidhidh air an comharrachadh ann an gorm.Tha fuigheall Cysteine ​​​​air a chomharrachadh ann an dearg.Tha crìochan fearainn agus eileamaidean structar àrd-sgoile air an sealltainn aig mullach a’ cho-thaobhadh, far a bheil saighdean a’ comharrachadh β-iallan agus tonnan a’ comharrachadh helices.Is e Comharran Ruigsinneachd NCBI anns a bheil na sreathan: daonna (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucopaeus, XP_011821277), muncaidh capuchin (Cebus mimic, XP_017359366), each (Equus caballus, XP 6), marbhadh 3 XP_032_034) .), caoraich (Ovis aries, XP_014955560), ailbhean (Loxodonta africana, XP_010585293), cù (Canis lupus familyis, XP_025277208), luchag (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian africana, XPSar1, diabhal 3 (XP14, XPSar1), Tasmanian diabhal_03, XPSar1, diabhal , 8) , 61_89 agus Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Tha an àireamh stèidhichte air òrdugh daonna.b Riochdachadh uachdar de structar SPACA6 le 4HB aig a’ mhullach agus fearann ​​​​coltach ri Ig aig a ’bhonn, dathan stèidhichte air tuairmsean glèidhteachais bhon t-seirbheisiche ConSurf.Tha na pàirtean glèidhte as fheàrr ann an gorm, tha na pàirtean meadhanach glèidhte ann an geal, agus tha an fheadhainn as lugha glèidhte ann am buidhe.cysteine ​​purpaidh.Tha trì pìosan uachdar a tha a 'sealltainn ìre àrd de dhìon air an sealltainn anns na pìosan 1, 2 agus 3 le bileagan inset.
Tha trì roinnean uachdar glèidhte ann an structar SPACA6 (Fig. 6b).Tha Patch 1 a’ dol thairis air 4HB agus an sgìre lùdagach agus tha dà dhrochaid disulfide CXXC glèidhte ann, lìonra lùdag Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Fig. S7), agus trì fuigheall cùbhraidh a-muigh glèidhte (Phe31, Tyr73, Phe137)).iomall nas fharsainge den àrainn coltach ri Ig (Fig. S6e), a tha a 'riochdachadh grunn fhuigheall le deagh chìsean air uachdar an sperm.Gu h-inntinneach, tha epitope antibody anns a’ phìos seo a chaidh a dhearbhadh roimhe a chuir bacadh air gnìomh SPACA6 30.Tha Roinn 3 a’ dol thairis air an lùdag agus aon taobh den fhearann ​​coltach ri Ig;tha prolines glèidhte anns an roinn seo (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) agus fuigheall pòlach / fo chasaid a tha a’ coimhead a-muigh.Gu h-iongantach, tha a 'mhòr-chuid de na tha air fhàgail air uachdar 4HB gu math caochlaideach (Fig. 6b), ged a tha am filleadh air a ghleidheadh ​​​​air feadh homologue SPACA6 (mar a tha air a chomharrachadh le glèidhteachas cridhe bundle hydrophobic) agus nas fhaide na an superfamily IST.
Ged is e seo an roinn as lugha ann an SPACA6 leis an àireamh as lugha de eileamaidean structarail àrd-sgoile, tha mòran de na tha air fhàgail de roinn lùdagan (a’ gabhail a-steach roinn 3) air an glèidheadh ​​gu mòr am measg homologues SPACA6, a dh’ fhaodadh a bhith a’ nochdadh gu bheil àite aig stiùireadh a’ phasgan helical agus β-ceapaire.mar neach-glèidhidh.Ach, a dh’ aindeoin ceanglaichean farsaing de hydrogen agus lìonraidhean electrostatach ann an sgìre lùdagach SPACA6 agus IZUMO1, tha fianais air sùbailteachd gnèitheach ri fhaicinn ann an co-thaobhadh nan iomadh structar ceadaichte aig IZUMO137,43,44.Bha co-thaobhadh nan raointean fa leth a’ dol an lùib a chèile gu math, ach bha treòrachadh nan raointean an coimeas ri chèile ag atharrachadh bho 50 ° gu 70 ° bhon axis mheadhanach (Fig. S16).Gus tuigse fhaighinn air daineamaigs co-rèiteachaidh SPACA6 ann am fuasgladh, chaidh deuchainnean SAXS a dhèanamh (Fig. S17a,b).Ab initio ath-thogail den SPACA6 ectodomain conformed structar criostal slat (Fig. S18), ged a tha an cuilbheart Kratky sheall beagan sùbailteachd (Fig. S17b).Tha an co-chòrdadh seo eadar-dhealaichte ri IZUMO1, anns a bheil am pròtain neo-cheangailte a’ gabhail ri cumadh boomerang an dà chuid anns an leusair agus ann am fuasgladh43.
Gus an roinn sùbailte a chomharrachadh gu sònraichte, chaidh mòr-speactroscopaidh iomlaid hydrogen-deuterium (H-DXMS) a dhèanamh air SPACA6 agus an coimeas ri dàta a fhuaireadh roimhe air IZUMO143 (Fig. 7a,b).Tha e soilleir gu bheil SPACA6 nas sùbailte na IZUMO1, mar a chithear leis an iomlaid deuterium nas àirde air feadh an structair às deidh 100,000 s de iomlaid.Anns an dà structar, tha am pàirt C-terminal den roinn lùdag a’ nochdadh ìre àrd de iomlaid, a tha is dòcha a’ ceadachadh cuairteachadh cuibhrichte de raointean coltach ri 4HB agus Ig an coimeas ri chèile.Gu inntinneach, tha am pàirt C-terminal de lùdag SPACA6, anns a bheil fuigheall 147CDLPLDCP154, na roinn 3 a tha gu math glèidhte (Fig. 6b), is dòcha a’ nochdadh gu bheil sùbailteachd eadar-roinne na fheart a tha air a ghleidheadh ​​​​gu mean-fhàs de SPACA6.A rèir mion-sgrùdadh sùbailteachd, sheall dàta leaghadh teirmeach CD gu bheil SPACA6 (Tm = 51.2 ° C) nas seasmhaiche na IZUMO1 (Tm = 62.9 ° C) (Fig. S1e agus S19).
a dealbhan H-DXMS de SPACA6 agus b IZUMO1.Chaidh ìre iomlaid Deuterium gu tala thairis air grunn làithean air an sealltainn sa chlàr.Tha ìrean iomlaid hydrogen-deuterium air an comharrachadh le dath air sgèile caisead bho ghorm (10%) gu dearg (90%).Tha bogsaichean dubha a 'riochdachadh raointean de iomlaid àrd.Tha crìochan 4HB, lùdag agus àrainn coltach ri Ig a chaidh fhaicinn anns an structar criostail air an sealltainn os cionn an t-sreath bun-sgoile.Chaidh ìrean iomlaid Deuterium aig 10 s, 1000 s, agus 100,000 s a dhealbhadh air clàr stiallach air a chuir thairis air uachdar moileciuil follaiseach SPACA6 agus IZUMO1.Tha pàirtean de structaran le ìre iomlaid deuterium fo 50% air an dath geal.Tha raointean os cionn 50% iomlaid H-DXMS air an dath ann an sgèile caisead.
Tha cleachdadh ro-innleachdan ginteil CRISPR/Cas9 agus gine lucha air leantainn gu comharrachadh grunn nithean a tha cudromach airson ceangal sperm is ugh agus fusion.A bharrachd air an eadar-obrachadh le deagh charactar eadar structar IZUMO1-JUNO agus CD9, tha a’ mhòr-chuid de na pròtanan co-cheangailte ri fusion gamete fhathast ann an structar agus gnìomh enigmatic.Tha caractar bith-fhiosaigeach agus structarail SPACA6 na phìos eile den tòimhseachan moileciuil adhesion / fusion aig àm torrachadh.
Tha coltas gu bheil SPACA6 agus buill eile de theaghlach IST air an glèidheadh ​​gu mòr ann am mamalan a bharrachd air eòin fa leth, snàgairean agus muir-thìrich;gu dearbh, thathas den bheachd gu bheil feum air SPACA6 eadhon airson torrachadh ann an zebrafish 59. Tha an cuairteachadh seo coltach ri pròtanan eile a tha aithnichte co-cheangailte ri fusion gamete leithid DCST134, DCST234, FIMP31, agus SOF132, a’ moladh gu bheil na factaran sin easbhaidheach HAP2 (cuideachd). ris an canar GCS1) pròtanan a tha cunntachail airson gnìomhachd catalytach mòran de luchd-iomairt., lusan, agus artrapod.Pròtainean fusion torrach 60, 61. A dh'aindeoin an structar làidir a tha coltach eadar SPACA6 agus IZUMO1, dh'adhbhraich cur às do ghinean a bha a' còdachadh aon de na pròtanan sin neo-thorrachas ann an luchagan fireann, a' sealltainn nach eil na gnìomhan aca ann am fusion gamete air an dùblachadh..San fharsaingeachd, chan eil feum air gin de na pròtanan sperm aithnichte a tha riatanach airson ìre adhesion fusion.
Tha e fhathast na cheist fhosgailte a bheil SPACA6 (agus buill eile de theaghlach IST) a’ gabhail pàirt ann an cinn-rathaid eadar-gaimigeach, a’ cruthachadh lìonraidhean intragamatic gus pròtanan cudromach fhastadh gu puingean fusion, no is dòcha eadhon a bhith nan fusogens so-ruigsinneach.Nochd sgrùdaidhean co-immunoprecipitation ann an ceallan HEK293T eadar-obrachadh eadar IZUMO1 làn-fhaid agus SPACA632.Ach, cha do rinn na h-ectodomains ath-leasaichte againn eadar-obrachadh in vitro, a’ moladh gun robh na h-eadar-obrachaidhean a chithear ann an Noda et al.Chaidh an dà chuid a dhubhadh às anns an togail (thoir fa-near earball cytoplasmic IZUMO1, a chaidh a dhearbhadh nach eil feum air airson torrachadh62).Air an làimh eile, dh’ fhaodadh gum bi feum aig IZUMO1 agus/no SPACA6 air àrainneachdan ceangail sònraichte nach bi sinn ag ath-riochdachadh in vitro, leithid co-chòrdalachd sònraichte a thaobh eòlas-eòlas no iom-fhilltean moileciuil anns a bheil pròtanan eile (aithnichte no nach deach a lorg fhathast).Ged a thathas a’ creidsinn gu bheil an ectodomain IZUMO1 a’ ceangal spermatozoa ris an ugh anns an àite perivitelline, chan eil adhbhar an SPACA6 ectodomain soilleir.
Tha structar SPACA6 a’ nochdadh grunn uachdar glèidhte a dh’ fhaodadh a bhith an sàs ann an eadar-obrachaidhean pròtain-pròtain.Anns a’ phàirt glèidhte den roinn lùdagach dìreach ri taobh motif CXXC (ainmichte Patch 1 gu h-àrd) tha grunn fhuigheall cùbhraidh a tha a’ coimhead a-muigh a tha gu tric co-cheangailte ri eadar-obrachaidhean hydrophobic agus π-cruachadh eadar biomolecules.Tha taobhan farsaing an fhearainn coltach ri Ig (sgìre 2) a’ cruthachadh clais le deagh chasaid le Arg agus na tha air fhàgail aige, agus chaidh antibodies an aghaidh na roinne seo a chleachdadh roimhe seo gus casg a chuir air gamete fusion 30 .Tha an antibody ag aithneachadh an epitope sreathach 212RIRPAQLTHRGTFS225, aig a bheil trì de na sia fuigheall arginine agus His220 glèidhte gu mòr.Chan eil e soilleir a bheil an dysfunction mar thoradh air bacadh air na fuigheall sònraichte sin no an roinn gu lèir.Tha suidheachadh a’ bheàirn seo faisg air ceann-uidhe C an ceapaire β a’ comharrachadh cis-eadar-obrachaidhean le pròtanan sperm faisg air làimh, ach chan ann le pròtanan oocyte.A bharrachd air an sin, faodaidh gleidheadh ​​​​tangle làn-shùbailte làn-shùbailte (làrach 3) taobh a-staigh an lùdag a bhith mar làrach eadar-obrachadh pròtain-pròtain no, nas coltaiche, a bhith a 'comharrachadh gleidheadh ​​​​sùbailteachd eadar an dà raon.Tha gnè cudromach airson àite neo-aithnichte SPACA6.measgachadh de gametes.
Tha feartan aig SPACA6 de phròtainean gluasaid eadar-cheallach, a’ toirt a-steach ceapairean β-coltach ri Ig.Tha aon raon β-ceapaire no barrachd aig mòran de phròtainean adhesive (me, cadherins, integrins, adhesins, agus IZUMO1) a leudaicheas pròtanan bhon membran cealla gu na targaidean àrainneachd aca63,64,65.Ann an raon coltach ri Ig de SPACA6 tha motif a lorgar gu cumanta ann an β-ceapairean de adhesion agus co-leanailteachd: dùblaidhean de iallan co-shìnte aig cinn ceapairean β, ris an canar clamps meacanaigeach66.Thathar a 'creidsinn gu bheil an motif seo a' meudachadh strì an aghaidh feachdan rùsgaidh, a tha luachmhor airson pròtainean a tha an sàs ann an eadar-obrachadh eadar ceallach.Ach, a dh'aindeoin an coltas seo ri adhesins, chan eil fianais sam bith ann an-dràsta gu bheil SPACA6 ag eadar-obrachadh le gealaich ugh.Chan urrainn don SPACA6 ectodomain ceangal a dhèanamh ri JUNO, agus cha mhòr gu bheil ceallan HEK293T a tha a’ cur an cèill SPACA6, mar a chithear an seo, ag eadar-obrachadh le oocytes aig nach eil sòn 32 .Ma stèidhicheas SPACA6 bannan eadar-gaimigeach, dh’ fhaodadh gum bi feum aig na h-eadar-obrachaidhean sin air atharraichean iar-eadar-theangachaidh no gum bi iad air an daingneachadh le pròtanan sperm eile.Mar thaic don bheachd-bharail mu dheireadh, tha spermatozoa easbhaidheach IZUMO1 a’ ceangal ri oocytes, a’ sealltainn gu bheil moileciuilean a bharrachd air IZUMO1 an sàs anns a’ cheum gèilleadh gamete 27 .
Tha feartan aig mòran de phròtainean fusion viral, ceallach agus leasachaidh a tha a’ ro-innse an gnìomh mar fusogens.Mar eisimpleir, tha glycoprotein fusion viral (clasaichean I, II agus III) le peptide no lùb fusion hydrophobic aig deireadh a’ phròtain a tha air a chuir a-steach don membran aoigheachd.Cha do sheall am mapa hydrophilicity de IZUMO143 agus structar (air a dhearbhadh agus air a ro-innse) den superfamily IST peptide fusion hydrophobic sam bith a rèir coltais.Mar sin, ma tha pròtanan sam bith anns an superfamily IST ag obair mar fusogens, bidh iad a’ dèanamh sin ann an dòigh eadar-dhealaichte bho eisimpleirean aithnichte eile.
Gu crìch, tha gnìomhan buill de theaghlach IST de phròtainean co-cheangailte ri fusion gamete fhathast nan dìomhaireachd iongantach.Bheir ar moileciuil ath-chuingealaichte SPACA6 comharraichte agus an structar fuasglaidh aige sealladh dhuinn air na dàimhean eadar na structaran co-roinnte sin agus am pàirt ann an ceangal gamete agus fusion.
Chaidh an t-sreath DNA a tha a rèir an ectodomain SPACA6 daonna a bha dùil (àireamh aontachaidh NCBI NP_001303901.1; fuigheall 27–246) a mheudachadh le codon airson a chuir an cèill ann an ceallan Drosophila melanogaster S2 agus air a cho-chur mar chriomag gine leis an t-sreath còdachadh Kozak (Eurofins Genomics)., an comharra secretion BiP agus an 5 ′ agus 3 ′ co-fhreagarrach a’ tighinn gu crìch airson clonadh neo-eisimeileach ligation den ghine seo a-steach do vectar abairt pMT stèidhichte air neach-adhartachaidh metallothionein air atharrachadh airson taghadh le puromycin (pMT-puro).Bidh an vectar pMT-puro a’ còdachadh làrach sgoltadh thrombin agus an uairsin taga C-terminal 10x-His (Figear S2).
Chaidh tar-chur seasmhach de vectar SPACA6 pMT-puro a-steach do cheallan D. melanogaster S2 (Gibco) a dhèanamh coltach ris a’ phròtacal a chaidh a chleachdadh airson IZUMO1 agus JUNO43.Chaidh ceallan S2 a leaghadh agus fhàs ann am meadhan Schneider (Gibco) le taic bho dùmhlachd deireannach de 10% (v / v) serum laogh fetal neo-ghnìomhach teas (Gibco) agus antibiotic antimycotic 1X (Gibco).Bha ceallan trannsa tràth (3.0 x ceallan 106) air an cur ann an tobraichean fa leth de phlàtaichean 6-tobar (Corning).Às deidh 24 uairean de ghoir aig 27 ° C, chaidh ceallan a ghluasad le measgachadh de 2 mg de vectar SPACA6 pMT-puro agus ath-ghluasad gluasaid Effectene (Qiagen) a rèir protocol an neach-dèanamh.Chaidh ceallan tar-chuir a ghluasad airson 72 uair agus an uairsin am buain le puromycin 6 mg / ml.Chaidh ceallan an uairsin a sgaradh bho mheadhan Schneider iomlan agus an cur ann am meadhan Insect-XPRESS gun serum (Lonza) airson cinneasachadh pròtain air sgèile mhòr.Chaidh baidse 1 L de chultar cealla S2 fhàs gu ceallan 8–10 × 106 ml-1 ann am flasg polypropylene Erlenmeyer le bonn còmhnard le fionnarachadh 2 L agus an uairsin air a sterilachadh le dùmhlachd deireannach de 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) agus sìoladh sterile.brosnaich.Bha na cultaran brosnaichte air an goir aig 27 ° C. aig 120 rpm airson ceithir latha.
Chaidh meadhan le suidheachadh anns a bheil SPACA6 a chuir air leth le centrifugation aig 5660 × g aig 4 ° C agus an uairsin siostam sìoltachaidh sruthadh tangential Centramate (Pall Corp) le membran 10 kDa MWCO.Cuir a-steach meadhan dùmhail anns a bheil SPACA6 gu colbh 2 ml de roisinn agarose Ni-NTA (Qiagen).Chaidh an roisinn Ni-NTA a nighe le 10 leabhraichean colbh (CV) de bufair A agus an uairsin chaidh 1 CV de bufair A a chuir ris gus dùmhlachd imidazole deireannach de 50 mM a thoirt seachad.Chaidh SPACA6 a chuir às le 10 ml de bufair A le taic bho imidazole gu dùmhlachd deireannach de 500 mM.Chaidh thrombin clas cuibhreachaidh (Millipore Sigma) a chuir gu dìreach ris an tubing dialysis (MWCO 12-14 kDa) aig aonad 1 gach mg SPACA6 vs 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 agus 150 mM NaCl (bufair B) airson dialysis.) aig 4 ° C airson 48 uairean.Chaidh an SPACA6 a bha air a ghlanadh le thrombin an uairsin a lagachadh trì-fhillte gus dùmhlachd salainn a lughdachadh agus a luchdachadh air colbh iomlaid cation 1 ml MonoS 5/50 GL (Cytiva / GE) air a chothromachadh le 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.Chaidh an iomlaidear cation a nighe le 3 CV de 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, an uairsin chaidh SPACA6 a chuir às le caisead sreathach de 0 gu 500 mM NaCl ann an 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 airson 25 CV.Às deidh cromatagrafaidheachd iomlaid ion, bha SPACA6 air a chuimseachadh gu 1 ml agus air a chuir air falbh gu isocratach bho cholbh ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) air a chothromachadh le bufair B. A rèir a’ chromatogram, bloighean amar agus dùmhlachd anns a bheil SPACA6.Bha purity air a smachdachadh le electrophoresis dhathte Coomassie air gel 16% SDS-polyacrylamide.Chaidh dùmhlachd pròtain a thomhas le sùghadh aig 280 nm a’ cleachdadh lagh Beer-Lambert agus an co-èifeachd dol à bith molar teòiridheach.
Chaidh SPACA6 puraichte a dhì-ghalarachadh thar oidhche an aghaidh sodium phosphate 10 mM, pH 7.4 agus 150 mM NaF agus air a lagachadh gu 0.16 mg / mL mus deach mion-sgrùdadh le CD spectroscopy.Chaidh sganadh speactram de CDan le tonn-tonn de 185 gu 260 nm a chruinneachadh air speactropolarimeter Jasco J-1500 a’ cleachdadh cuvettes quartz le fad slighe optigeach 1 mm (Helma) aig 25 ° C aig ìre 50 nm / min.Chaidh an speactra CD a cheartachadh mar bhun-loidhne, cuibheasachd thairis air 10 togail, agus atharrachadh gu bhith a’ ciallachadh ellipticity iarmharach (θMRE) ann an ceumannan cm2 / dmol:
far a bheil MW na chuideam moileciuil airson gach sampall ann an Da;Is e N an àireamh de amino-aigéid;θ tha an ellipticity ann am millidegrees;d a 'freagairt ri fad na slighe optigeach ann an cm;dùmhlachd pròtain ann an aonadan.