310 10 * 1mm Co-phàirt ceimigeach tubing coiled stàilinn, Bidh na raointean N-terminal de spidroin a’ cruthachadh hydrogels stèidhichte air fibrilean amyloid agus a ’toirt seachad àrd-ùrlar airson gluasad pròtain.

Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com.Tha thu a’ cleachdadh dreach brobhsair le taic CSS cuibhrichte.Airson an eòlas as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu brobhsair ùraichte (no cuir à comas Modh Co-chòrdalachd ann an Internet Explorer).A bharrachd air an sin, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, bidh sinn a 'sealltainn an làrach gun stoidhlichean agus JavaScript.
Sleamhnagan a’ sealltainn trì artaigilean gach sleamhnag.Cleachd na putanan air ais is air adhart gus gluasad tro na sleamhnagan, no na putanan rianadair sleamhnag aig an deireadh gus gluasad tro gach sleamhnag.

Sònrachadh

310 10 * 1mm solaraichean pìoban coiled stàilinn

Co-dhèanamh ceimigeach

Feartan meacanaigeach

Tha mòran thagraidhean comasach aig pròtanan sìoda damhain-allaidh ath-chuingealaichte (pròtinean sìoda damhain-allaidh) ann a bhith a’ leasachadh bith-stuthan ùra, ach tha an nàdar ioma-mhodhail agus cruinneachaidh gan dèanamh duilich an lorg agus furasta an cleachdadh.An seo tha sinn ag aithris gu bheil pròtanan spidroin ath-chuingealaichte agus, gu cudromach, an àrainn N-terminal (NT) fhèin gu luath a’ cruthachadh hydrogels fèin-thaiceil agus follaiseach aig 37 ° C.Bidh pròtanan fusion anns a bheil NT agus pròtain flùraiseach uaine no purine nucleoside phosphorylase a’ cruthachadh pròtanan fusion làn-ghnìomhach.Hydrogels.Tha na co-dhùnaidhean againn a’ sealltainn gu bheil pròtainean NT agus fusion ath-leasaichte a’ toirt seachad toradh àrd faireachdainn agus a’ toirt buaidh air hidrogels le feartan tarraingeach leithid follaiseachd, gelation gun tar-cheangal, agus gluasad dìreach de phròtainean gnìomhach aig dùmhlachd àrd.
Tha suas ri seachd seataichean eadar-dhealaichte de fàireagan sìoda aig damhain-allaidh, gach fear a’ toirt a-mach seòrsa sònraichte de shìoda.Tha na seachd gnèithean sìoda air an dèanamh suas de phròtainean sìoda damhain-allaidh (spidroins) timcheall air 6000 fuigheall a dh’ fhaid agus tha sgìre ath-chuairteachaidh mòr sa mheadhan air a chuairteachadh le raointean spherical N- agus C-terminal (NT agus CT)1,2.Tha an seòrsa sìoda as fharsainge a chaidh a sgrùdadh, am bun-ampulla, air a thoirt a-mach leis a’ phrìomh ampula gland.Anns an gland seo, bidh monolayer de cheallan epithelial a ’dèanamh synthesis de phròtainean spidroin agus gan cuir a-steach do lumen an gland, far a bheil iad an làthair ann an cruth solubhail (dopadh) aig dùmhlachdan fìor àrd (30-50% w / v) 3,4.Chaidh deasbad a dhèanamh air eagrachadh agus co-chòrdadh nam prìomh phròtainean spidroin ampulular anns a’ ghland, ach tha a’ mhòr-chuid de dh’fhianais dheuchainneach a’ nochdadh gu bheil co-chòrdadh helical san fharsaingeachd agus/no air thuaiream agus structaran micellar no lamellar5,6,7,8,9,10 ann.Fhad ‘s a bhios na raointean ath-aithris a’ riaghladh feartan meacanaigeach snàithleach sìoda, a ’cruthachadh nanocrystals β-duilleag agus structaran amorphous11,12,13,14,15, bidh raointean crìochnachaidh a’ riaghladh snàithleanan sìoda mar fhreagairt air suidheachaidhean caochlaideach air feadh an gland sìoda16,17,18.Le bhith a’ cumail smachd air cruthachadh sìoda, 19. Tha raointean crìochnachaidh air an gleidheadh ​​​​gu mean-fhàsach agus faodaidh an gnìomh aca a bhith cumanta do phròtainean spidroin uile 2,20,21.Nuair a bhios tu a’ siubhal tron ​​​​ghalar, bidh pH an spidroin a’ dol sìos bho timcheall air 7.6 gu <5.716 agus ag àrdachadh le rùsgadh agus sìneadh air a mheadhanachadh le gluasad tron ​​duct a tha a’ caolachadh mean air mhean.Ann am fuasgladh, tha CT na dimer17 co-shìnte constitutive α-helical, ach mar fhreagairt do pH ìosal agus feachdan rùsgaidh, bidh CT a ’leudachadh agus a’ tionndadh β-layers16, 17, is dòcha a ’piobrachadh β-layers ann an roinnean ath-aithriseach Tionndadh 16. Tha NT monomeric fo. suidheachaidhean a tha a’ nochdadh suidheachadh ann an lumen an gland agus a’ meadhanachadh solubility spidroin, ach aig pH nas ìsle, bidh protonation de ghrunn shlabhraidhean taobh searbhag carboxylic a’ leantainn gu lùghdachadh NT le pKa de mu 6.5, mar sin a’ bunailteachadh NT agus a’ càradh spidroin ann am meudan mòra. meudan.lìonraidhean16,18.Mar sin, tha prìomh phàirt aig NT ann an cruthachadh filament, ag atharrachadh bho monomer anns a’ chòmhdach gu dimer anns an fiber23,24,25.Tha NT fhathast gu math so-sgaoilte agus helical fo gach suidheachadh a chaidh a sgrùdadh gu ruige seo16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, a bhrosnaich a leasachadh mar leubail àrdachadh solubility airson cinneasachadh pròtainean heterologous.
Tha pròtain sìoda damhain-allaidh beag ath-chuimseach, air a dhèanamh suas de aon NT, aon roinn ath-aithris ghoirid, aon CT, agus tag His6 (His-NT2RepCT) airson glanadh, cho so-sgaoilte ann am bufair uisgeach ri pròtain sìoda damhain-allaidh dùthchasach agus ag atharrais air feartan dùthchasach damhain-allaidh sìoda. .còmhdach 25.31.Faodar His-NT2RepCT a shnìomh gu snàithleach leantainneach le bhith a’ cleachdadh inneal biomimetic anns a bheil còmhdach soluble pH 8 air a thoirt a-steach do amar uisge pH 525,32,33,34,35.Mar thoradh air coipeadh bioreactor de E. coli a’ cur an cèill His-NT2RepCT agus an dèidh làimhseachadh às deidh sin thàinig toradh> 14 g/L às deidh glanadh.Tha toradh àrd, sùbailteachd àrd, agus freagairt iomchaidh His-NT2RepCT gu suidheachaidhean searbhach uile air an cur an cèill gu NT23, 25, 34.
An seo tha sinn ag aithris air cruthachadh luath de hydrogels follaiseach bho phròtainean spidroin ath-chuingealaichte, a ’toirt a-steach NT leis fhèin, le bhith a’ toirt a-steach fuasgladh pròtain aig 37 ° C.A’ cleachdadh fluorescence thioflavin T (ThT), cruth-atharraich Fourier speactroscopaidh infridhearg (FTIR), speactroscopaidh ath-shuidheachadh magnetach niùclasach (NMR) agus microscopy dealanach tar-chuir (TEM), lorg sinn gu bheil pròtanan NT agus microspider a’ dol tro atharrachadh structarail gu β-sheets agus fibrils coltach ri amyloid. nuair a thèid gels a chruthachadh.A bharrachd air an sin, bidh pròtanan fusion de NT agus pròtain flùraiseach uaine (GFP) no purine nucleoside phosphorylase (PNP) a’ cruthachadh hydrogels le mìrean fusion làn-ghnìomhach.Tha faireachdainn àrd-thràth ann an luchd-aoigheachd heterologous, còmhla ri cruthachadh luath de hydrogels fo chumhachan eòlas-inntinn, a’ fosgladh a’ chothruim cinneasachadh cosg-èifeachdach de hydrogels le gnìomhan innleadaireachd.
Eu-coltach ris a’ mhòr-chuid de phròtainean spidroin ath-leasaichte36 a chaidh aithris, tha His-NT2RepCT seasmhach ann am bufair Tris-HCl aig pH 8 agus faodar a chuimseachadh suas gu 500 mg / mL gun sileadh25.Mar sin, chuir e iongnadh oirnn faighinn a-mach gu bheil am pròtain seo gu luath a’ cruthachadh hidrogels fèin-thaiceil a tha soilleir gu optigeach nuair a thèid an goir aig 37 ° C (Fig. 1b-d).Sheall sgrùdaidhean eile gun do thachair gelation His-NT2RepCT thairis air raon farsaing de chruinneachaidhean pròtain (10-300 mg / mL) agus gun robh an dùmhlachd seo co-cheangailte gu mì-chothromach ri ùine gelation (Fig. 1c agus Fig. 1 Leasachail).Gus faighinn a-mach dè na pàirtean de His-NT2RepCT a tha a’ toirt a-steach cruthachadh hydrogel, rinn sinn sgrùdadh an uairsin air gach raon leotha fhèin agus ann an grunn choimeasgaidhean a’ cleachdadh assay tionndaidh flasg (Figear 1a, b).Chruthaich a h-uile bloigh deuchainneach de spidroin ath-chuingealaichte gels (aig dùmhlachd pròtain de 300 mg / mL) ann an nas lugha na 1 h, ach a-mhàin 2 Rep le sileadh (Fig. 1b).Tha seo a’ moladh gum faod NT agus CT leotha fhèin, ann an co-bhonn, no co-cheangailte ri ath-chraolaidhean, glaodhadh aig 37 ° C agus nach toir an taga His6 buaidh air a’ phròiseas seo gu ìre mhòr.Leis a’ bheachd chumanta gur e pròtain làn solubhail agus seasmhach a th’ ann an NT, agus gu bheil aithisgean roimhe seo de hydrogels spidroin ath-leasaichte air buaidh gelation a thoirt gu atharrachaidhean co-chòrdalachd ann an roinnean ath-aithris agus / no CTn, dh’ fhaodadh NT fhèin.Cha robh dùil ri gelation a lorg.Clàr Leasachail 1) 37, 38, 39. Gu h-iongantach, bha NT mu thràth air gèilleadh taobh a-staigh 10 mionaidean aig dùmhlachd ≥ 300 mg/mL (Fig. 1c).Sheall deuchainnean tionndaidh vial le diofar cho-chruinneachaidhean de NT gun robh am fuasgladh NT aig> 50 mg / mL nas luaithe na His-NT2RepCT aig an ìre co-fhreagarrach (w / v, Figear 1c).
Riochdachadh sgeamach de dhiofar chruthan spidroin air an sgrùdadh san obair seo.b Ùine gel aig 37 ° C airson diofar phròtainean spidroin ath-chuingealaichte (300 mg / mL) air a dhearbhadh le bhith a’ tionndadh an vial.Gel CT sa bhad às aonais goir (<300 mg / mL), precipitates 2Rep (300 mg / mL, sgèile 5 mm).c Ùine gel de His-NT2RepCT agus NT aig dùmhlachdan pròtain comharraichte aig 37 ° C.d Dealbhan de His-NT2RepCT agus NT hydrogels leis an damhan-allaidh agus an litir “NT” air a chlò-bhualadh gu h-ìosal, fa leth (an dà chuid 200 mg / mL, bàr sgèile 5 mm).
Tha dathan beagan eadar-dhealaichte aig hidrogels a tha air an cruthachadh le diofar phròtainean spidroin ath-chuingealaichte, agus tha sgrùdadh sùla rùisgte a’ nochdadh diofar ìrean de fhollaiseachd (Fig. 1b).Tha gels NT air leth soilleir fhad ‘s a bhios gels eile a’ fàs neo-shoilleir.Dh’ fhaodadh gels His-NT2RepCT agus NT a chaidh a thilgeil a-steach do phìoban siolandair an toirt air falbh bhon mholltair slàn (Fig. 1d).
Gus dearbhadh a bheil còmhdach sìoda damhain-allaidh nàdarrach gel fo chumhachan a chaidh a lorg a-nis ag adhbhrachadh gelation de na pròtanan spidroin ath-chuingealaichte, chaidh còmhdach a chruinneachadh bho gland mòr ampulla damhan-allaidh drochaid Suaineach (Larinioides sclopetarius).Chaidh còmhdach a stòradh ann am bufair Tris-HCl 20 mM aig 50 mg / mL (stèidhichte air cuideam tioram tomhais), ach cha deach gelation sam bith fhaicinn rè an goir latha 21 aig 37 ° C (Figear Leasachail 2a).
Gus na gels sin a thomhas, faodar tomhasan reul-eòlais a chleachdadh gus am pròiseas gelation a sgrùdadh agus na feartan meacanaigeach iomlan a dhearbhadh.Gu sònraichte, le bhith a’ cumail sùil air modulus stòraidh (elasticity) aig teòthachd àrdaichte faodaidh e fiosrachadh a thoirt seachad mun teòthachd gelling a bharrachd air feartan viscoelastic a ’chòmhdaich.Sheall deuchainnean àrdachadh teòthachd (a’ cleachdadh 1 ° C / min aig 25-45 ° C, stèidhichte air sgrùdaidhean roimhe a’ cleachdadh fuasglaidhean stoc sìoda nàdarra) 40,41 gun do mheudaich moduli stòraidh fuasglaidhean His-NT2RepCT agus NT le àrdachadh teòthachd .air a mheudachadh (Fig. 2 agus Fig. 3 Leasachail).Gu sònraichte, thòisich am modal NT a ’fàs aig teòthachd nas ìsle an taca ri His-NT2RepCT, a rèir na h-ùine gel nas luaithe a chaidh fhaicinn nuair a chaidh NT a bhrosnachadh gu dìreach le His-NT2RepCT aig 37 ° C (Figear 1).Às deidh tuiteam ann an teòthachd às deidh sin, cha do thill am modulus stòraidh gu luachan nas ìsle agus dh’ fhuirich e os cionn a ’mhodal call (faic Fig. 3 Leasachail), a’ nochdadh gelation seasmhach nach gabh a thoirt air ais gu teirmeach.Às deidh gelation, bha am modulus elastagach mu dheireadh eadar 15 agus 330 kPa airson hydrogels His-NT2RepCT aig dùmhlachd de 100-500 mg / mL, agus bha am modulus elastagach mu dheireadh airson hydrogels NT (100-500 mg / mL) eadar 2 agus 1400 kPa (Fig. , 2 agus dàta rampa iomlan) faic Fig. 3 a bharrachd).
a Atharrachadh ann an teòthachd rè tomhais His-NT2RepCT (300 mg / mL) agus b NT (300 mg / mL) le crathadh.Tha na saighdean a’ nochdadh gluasad teothachd, agus tha an dubhar nas aotroime de dhàta a’ mhodal stòraidh a’ nochdadh deuchainn aig luachan torque nas ìsle airson an ionnstramaid na chaidh a shònrachadh leis an neach-dèanamh, a tha ag adhbhrachadh barrachd fuaim.c Cruinneachadh modal deireannach de His-NT2RepCT agus NT às deidh teòthachd àrdaichte (100, 300, agus 500 mg / mL).Thèid a h-uile leughadh modal a ghabhail aig tricead 0.1 Hz.
Mar dhòigh a dh’ fhaodadh a bhith ann airson sgrùdadh a dhèanamh air atharrachaidhean co-chòrdalachd co-cheangailte ri gelation, chlàraich sinn speactra FTIR de His-NT2RepCT agus NT ro agus às deidh gelation aig 37 ° C (Figear 3a, b).Mar a bhiodh dùil, bha an speactra de fhuasglaidhean His-NT2RepCT agus NT a’ freagairt ri pròtanan a’ sealltainn structar àrd-sgoile coil α-helix / air thuaiream, le còmhlan ainmichte aig 1645 cm-1.Airson an dà hydrogels, thàinig gelation gu bhith a 'cruthachadh dà ghàirdeanan ann am bann meadhanach I aig mu 1617 cm-1 agus 1695 cm-1 (Fig. 3a, b), a' comharrachadh cruthachadh structaran antiparallel β-sheet.Tha na h-atharrachaidhean sin rim faicinn gu soilleir cuideachd anns an dàrna speactra derivative agus eadar-dhealachadh gelation (Fig. 4b).Bha an dà chòmhlan den NT β-layer nas fhollaisiche na an fheadhainn aig His-NT2RepCT, a’ nochdadh gu robh susbaint iomlan bannan β-layer anns an NT hydrogel nas àirde na susbaint an hydrogel NT2RepCT.
speactra in-ghabhail FTIR de His-NT2RepCT agus b NT (an dà chuid 500 mg / mL) ro (fuasgladh) agus às deidh (glaineid) goir aig 37 ° C.c Ìomhaighean TEM de gels 50 mg / ml NT2RepCT ath-chuiridh agus d NT.Bàr sgèile 200 nm.e Trast-thomhas fiber de hydrogels His-NT2RepCT agus NT.n = 100 fibrils tomhais, p <0.0001.Tha na bàraichean mearachd a’ sealltainn an claonadh àbhaisteach.Is e meadhan nam bàraichean mearachd am meadhan.Chaidh deuchainn-t gun chàradh (dà-earball) a chleachdadh airson mion-sgrùdadh staitistigeil.f ThT fluorescence de dhiofar phròtainean spidroin ath-chuingealaichte (100 mg / mL) aig 37 ° C gun chrith.g NT (100 mg / mL) deuchainnean inoculation bho 100 mg / mL NT gel le sìol 0%, 5%, 10%, agus 20%.
Sheall mion-sgrùdadh air an gel le bhith a’ cleachdadh microscopy dealanach tar-chuir (TEM) gu bheil an hydrogel air a dhèanamh suas de fhibrilean coltach ri amyloid (Figs. 3c, 3d).Bha fibrilean cruth NT air an leudachadh (5-12 nm ann an trast-thomhas) agus gun mheur, fhad ‘s a bha fibrils His-NT2RepCT nas giorra de dh’ fhaid agus gu math nas fharsainge ann an trast-thomhas (7-16 nm) (Fig. 3e).Leig na co-dhùnaidhean sin leinn cinnt fibrosis a leantainn a’ cleachdadh assay thioflavin T (ThT).Airson a h-uile pròtain spidroin ath-chuingealaichte, mheudaich an comharra flùraiseach nuair a chaidh sampallan a thoirt a-steach aig 37 ° C (Fig. 3f, Fig. 5a a bharrachd).Co-chòrdail ris a’ cho-dhùnadh seo, nochd sgrùdadh microscopach air NT agus His-NT2RepCT fo chumhachan gelling àrdachadh èideadh ann an fluorescence ThT às aonais cruinneachadh ionadail follaiseach de cho-chruinneachaidhean ThT-positive (Fig. 5b,c a bharrachd).Cha robh àrdachadh ann an taiseachd NT agus His-NTCT (Fig. 5d Leasachail) an cois cruthachadh fibrilean ThT-positive, a tha a’ ciallachadh gum faodadh lìonra de fibrils anns an gel cruthachadh gun a bhith a’ toirt buaidh air soilleireachd gel.Faodaidh sìolachadh le bhith a’ cur meudan beaga de fibrilean ro-chruthaichte luathachadh mòr air cruthachadh fibril de chuid de amyloids42,43,44 ach a’ cur 5%, 10% no 20% (w / w) NT ri fuasgladh de hydrocoagulants NT.buaidh sìolachaidh (Fig. 3g).Is dòcha gu bheil seo air sgàth gu bheil na fibrils anns an hydrogel gu ìre mhath stèidhichte agus nach urrainnear an cleachdadh mar shìol.
Bhrosnaich giùlan ris nach robh dùil de phròtainean spidroin ath-chuingealaichte aig teòthachd àrd tuilleadh sgrùdaidhean speactroscopaidh ath-shuidheachadh magnetach niùclasach (NMR) gus atharrachaidhean co-chòrdalachd co-cheangailte ri cruthachadh gel a chomharrachadh.Sheall speactra NMR de fhuasglaidhean His-NT2RepCT a chaidh a chlàradh thar ùine aig 37 ° C gu robh CT fhathast air a phasgadh gu ìre, ach bha comharran NT agus 2Rep air a dhol à bith (Fig. 4a), a’ moladh gur e NT agus 2Rep sa mhòr-chuid a bha gu ìre a’ cumail smachd air cruthachadh His- NT2RepCT hydrogel.Chaidh an comharra CT a lughdachadh cuideachd gu 20% den dian tùsail aige, a ’moladh gu bheil CT cuideachd sa mhòr-chuid stèidhichte agus air a thoirt a-steach don structar hydrogel.Airson cuibhreann nas lugha den CT, a tha cho gluasadach ris an t-sampall ro-ghoirtichte agus mar sin air fhaicinn le fuasgladh NMR, tha dìth comharran anns an speactram airson a’ chiad 10 fuigheall structarail, is dòcha mar thoradh air gluasad duilich den chuibhreann ceangailte de His-NT2Rep.Nochd speactra NMR de -state hydrogels -NT2RepCT an làthaireachd as motha de α-helices agus β-layers agus, gu ìre nas lugha, an co-chòrdadh coil air thuaiream (Fig. 4b).Sheall mion-sgrùdadh gluasad ceimigeach air fuigheall methionine a bha an làthair a-mhàin ann an NT gun deach an raon seo atharrachadh gu structar duilleag β.Sheall an speactra a bha an urra ri ùine de NT ann am fuasgladh lùghdachadh èideadh ann an dian chomharran (Fig. 4c), agus sheall NMR stàite cruaidh de NT hydrogels gun deach a’ mhòr-chuid de na fuigheall NT atharrachadh gu structaran duilleag β (Fig. 4d).Cha b 'urrainnear co-chòrdadh 2Rep a dhearbhadh air leth air sgàth' s gu robh e buailteach a bhith a 'cruinneachadh.Ach, bha coltas gu math coltach ri speactra stàite cruaidh NMR de na hydrogels NTCT agus His-NT2RepCT (Fig. 4b; Fig. 6b), a’ moladh nach do chuir 2Rep mòran ris a’ phàirt structarail den hydrogel His-NT2RepCT.Airson CT hydrogels, chaidh α-helices, β-sheets, agus structaran àrd-sgoile helical air thuaiream a lorg (Fig. 6d a bharrachd).Tha seo a’ nochdadh gu bheil cuid de phàirtean den CT fhathast nan α-helices agus cuid eile a’ fàs nan β-sheets.Mar sin, tha toraidhean speactroscopaidh NMR a’ moladh gu bheil NT cudromach airson cruthachadh hydrogel agus cuideachd ag atharrachadh gu co-chòrdadh β-duilleag nuair a thèid e còmhla ri 2Rep agus CT.Co-chòrdail ri seo, lorg sinn o chionn ghoirid gu bheil coltas ann gu bheil zippers spàsail amyloid a’ cruthachadh anns na còig helices den raon NT, agus bha algairim Waltz a’ ro-innse sgìre amyloidogenic ann an helix 1 (Fig. 4e).
Spectra 2D de 15N-HSQC 10 mg / mL Fuasgladh His-NT2RepCT ro (gorm) agus 19 uairean às deidh goir (dearg) aig 37 ° C.Tha stùcan croise fa leth anns an speactram dearg agus F24, G136, polyA anns an speactram gorm air an comharrachadh le samhlaidhean aminoideach aon-litir agus àireamhan fuigheall.Tha na h-insets a’ sealltainn eisimeileachd dian nan comharran ann an àm airson fuigheall taghte bho na raointean NT, 2Rep, agus CT.b Spectra radiofrequency solid-state (RFDR) de hydrogels His-NT2RepCT.Chaidh co-dhàimhean de fhuigheall Cα / Cβ a chaidh an sgrùdadh ann an speactra RFDR a dhearbhadh le coimeas ri gluasadan ceimigeach modail peptide agus luachan a thàinig bho staitistig82,83 agus na structaran àrd-sgoile aca.SSB - bann-taobh rothlach.c Spectra aon-thaobhach de fhuasgladh 15N-HSQC 10 mg / mL NT aig àm goir aig 37 ° C airson 36 uairean.Tha an inset a’ sealltainn dian tomhas-lìonaidh an aghaidh ùine.d Spectra RFDR stàite cruaidh de NT hydrogels.Tha na co-dhàimhean eadar fuigheall Cα/Cβ agus na structaran àrd-sgoile aca a chaidh fhaicinn anns an speactram RFDR air an comharrachadh.e Stèidhichte air ìomhaigh claonadh fibrillation NT45.79 bhon stòr-dàta Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Tha lùth Rosetta de uinneag gluasad dealanaich spàsail an hexapeptide air a shealltainn ann an kcal/mol.Tha bàraichean dearga a’ comharrachadh hexapeptides le claonadh fibrosis àrd (lùth Rosetta fo -23 kcal / mol; fon loidhne dotagach).Tha bàraichean uaine a’ nochdadh mìrean le spionnadh Rosetta os cionn na stairsnich agus mar sin chan eil iad cho dualtach zippers steric a chruthachadh.Chaidh pìosan anns an robh proline a chuir a-mach às an anailis (às aonais colbhan).Tha ceàrnagan a’ comharrachadh raointean de amyloidosis air an ro-innse le algairim Waltz81 (https://waltz.switchlab.org).Tha an t-sreath de fhuigheall aminoideach NT aig a’ mhullach, agus tha na seòrsaichean fuigheall a lorgar ann an structar àrd-sgoile β (air a dhearbhadh le speactroscopaidh NMR stàite cruaidh) air an sealltainn ann an dearg.Tha suidheachadh nan còig NT α-helices air an comharrachadh mar (H1-H5)28.
Aig pH <6.5, bidh HT a’ lùghdachadh, le bhith an aghaidh dì-nàdarachadh teas no urea18.Gus soilleireachadh mar a tha lughdachadh NT agus seasmhachd a ’toirt buaidh air gelation, chaidh smachd a chumail air fuasglaidhean anns a bheil 100 mg / ml NT aig pH 8, 7, agus 6 a’ cleachdadh an deuchainn tionndaidh vial.Chaidh sampallan NT a bhrosnachadh aig pH 8 agus 7 gelled às deidh 30 min aig 37 ° C, ach dh’ fhan an gel pH 8 soilleir, fhad ‘s a bha an gel pH 7 a’ nochdadh sileadh faicsinneach (Fig. 5a).An coimeas ri sin, cha do chruthaich fuasgladh anns an robh HT aig pH 6 gel, agus bha sileadh mòr ri fhaicinn às deidh 20 min aig 37 ° C.Tha seo a 'moladh gu bheil lùghdachadh iad fhèin agus / no an seasmhachd nas àirde an coimeas ri monomers a' cur casg air gelation.Cha robh dùil ri cruthachadh precipitate airson NT aig pH 7 agus 6, oir chaidh aithris gu bheil NT solubhail aig 200 mg / ml27, gu furasta ath-fhilleadh às deidh dì-ghalarachadh teas, agus cuideachd a’ cumail α-helix aig luachan nas ìsle de pH 18. Is e mìneachadh a dh'fhaodadh a bhith air na h-eadar-dhealachaidhean sin gun deach na deuchainnean a chaidh aithris roimhe a dhèanamh aig teòthachd an t-seòmair no nas ìsle, no aig co-chruinneachaidhean pròtain coimeasach ìosal16,18,19.
Deuchainn tionndaidh vial NT (100 mg / mL) aig pH 8, 7, 6 agus 154 mM NaCl (pH 8) às deidh goir aig 37 ° C.b speactra CD NT le agus às aonais 154 mM NaF agus 154 mM NaCl, fa leth.Tha ellipticity molar aig 222 nm air a thionndadh gu cuibhreann de fhilltean nàdarra.c assay tionndaidh NT (100 mg / mL) NT * (37 ° C agus 60 ° C), NTA72R (37 ° C), agus His-NT-L6 (37 ° C agus 60 ° C).d spectra CD de NT mutants NT *, NTA72R, agus His-NT-L6.Tha ellipticity molar aig 222 nm air a thionndadh gu cuibhreann de fhilltean nàdarra.e Deuchainn tionndaidh de NTFlSp, NTMiSp agus NTMiSp lùghdaichte (100 mg/mL).Bàr sgèile 5 mm.f spectra CD de NT, NTFlSp, NTMiSp agus NTMiSp lùghdaichte.Tha ellipticity molar aig 222 nm air a thionndadh gu cuibhreann de fhilltean nàdarra.Tha speactra làn NT aig 25 ° C agus 95 ° C air an sealltainn ann am Figear Leasachail 8.
Bidh dùmhlachd salainn fios-eòlasach a’ dearbhadh eadar-obrachadh electrostatach eadar fo-aonadan NT agus lughdachadh gluasad NT gu pH18 nas ìsle.Fhuair sinn a-mach gun do chuir làthaireachd 154 mM NaCl agus NaF bacadh air gelation, fa leth (Fig. 5a, b; Fig. 2b a bharrachd) agus gun do mheudaich na salainn sin seasmhachd teirmeach monomers NT (Fig. 5b, Fig. 8 a bharrachd) .Tha e cuideachd a 'moladh gu bheil àrdachadh seasmhachd, seach lùghdachadh, a' cur casg air cruthachadh gel.
Gus tuilleadh sgrùdaidh a dhèanamh air àite lughdachadh pròtain agus seasmhachd ann an gelation, chleachd sinn dà mutants, NT * agus NTA72R, a tha cuideachd fhathast monomeric aig pH28.30 ìosal.Is e mutant tionndadh cosgais dùbailte a th’ ann an NT * anns a bheil cuairteachadh cosgais dipolar a tha coltach ris a ’monomer rèidh, a chuireas casg air lughdachadh agus a’ meudachadh seasmhachd monomer gu mòr.Tha NTA72R na dipole fo chasaid, ach tha Ala a chaidh a chuir an àite Arg suidhichte aig a’ chrìoch dimer, agus mar sin bidh mùthaidhean a ’cur bacadh air eadar-obrachaidhean fo-aonad a tha riatanach airson lughdachadh.Nuair a chaidh an goir aig 37 ° C, cha do chruthaich NT * hydrogel, agus chruthaich NTA72R gel neo-shoilleir airson 15 min (Fig. 5c).Leis nach urrainn an dà chuid NT * agus NTA72R lùghdachadh ach eadar-dhealaichte ann an seasmhachd monomer (Fig. 5d), tha na co-dhùnaidhean sin a’ moladh gu làidir gu bheil seasmhachd àrd thermodynamic a’ cur casg air NT bho gelling.Tha seo cuideachd a’ faighinn taic bhon fhìrinn gu bheil HT * a’ cruthachadh gel nuair a tha e neo-sheasmhach aig teòthachd àrd (às deidh 8 min aig 60 ° C; Fig. 5c).Chaidh a shealltainn roimhe seo gu bheil an t-susbaint àrd de methionine ann an NT a’ lionadh a phasgadh nàdarrach agus gu bheil sia luchd-ionaid Met to Leu (air an ainmeachadh an seo mar His-NT-L6) gu làidir a’ bunailteachadh monomer NT46.Stèidhichte air a’ bharail gu bheil feum air sùbailteachd structarail airson cruthachadh gel NT, lorg sinn nach do rinn an mutant seasmhach His-NT-L6 gel aig 37 ° C (Figear 5c, d).Ach, chruthaich His-NT-L6 gel cuideachd nuair a chaidh a ghoir aig 60 ° C airson 60 mionaid (Fig. 5c).
Tha e coltach gu bheil comas NT cruth-atharrachadh gu structaran β-duilleag agus cruth hydrogels a’ buntainn ri cuid de na raointean NT de spidroin ach chan eil iad uile.Chruthaich NTs bho dhiofar sheòrsaichean sìoda agus gnèithean damhan-allaidh, Trichonephila clavipes (NTFlSp), gels a dh’ aindeoin an ìre ìosal de methionine susbaint agus seasmhachd teirmeach àrd (Fig. 5e, f agus Clàr Leasachail 2).An coimeas ri sin, cha do chruthaich NT bhon spidroin pròtain ampulular beag bho Araneus ventricosus (NTMiSp) le seasmhachd teirmeach ìosal agus susbaint àrd methionine hydrogels (Clàr Leasachail 2 agus Fig. 5e, f).Dh’ fhaodadh an fheadhainn mu dheireadh a bhith co-cheangailte ri làthaireachd bannan disulfide intramolecular29,47.Gu cunbhalach, nuair a chaidh bannan disulfide NTMiSp a lughdachadh, chruthaich e hydrogel às deidh a bhith air a goir aig 37 ° C airson 10 mionaidean (Fig. 5e).Ann an co-dhùnadh, bu chòir a thoirt fa-near gu bheil sùbailteachd structarail na shlat-tomhais cudromach, ach chan e an aon shlat-tomhais airson cruthachadh gel bho NT.Is e feart eile a dh’ fhaodadh a bhith buntainneach an comas fibrils amyloid a chruthachadh, agus sheall mion-sgrùdadh leis an stòr-dàta zipper agus algorithm Waltz co-dhàimh eadar an comas gels a chruthachadh agus làthaireachd roinnean amyloidogenic, a bharrachd air ìre nan roinnean a bha dùil. gus zippers steric a chruthachadh.Bha co-dhàimh ann (Clàr Leasachail 2 agus Fig. 9 a bharrachd).
Le comas NT fibrils a chruthachadh agus gels a chruthachadh fo chumhachan fàbharach thug sinn beachd dhuinn gum faod fusions NT le mìrean pròtain eile fhathast gels a chruthachadh le làn ghnìomhachd com-pàirtichean fusion.Gus seo a dhearbhadh, thug sinn a-steach pròtain flùraiseach uaine (GFP) agus purine nucleoside phosphorylase (PNP) aig C-terminus an NT, fa leth.Chaidh na pròtanan fusion a thàinig às a sin a chuir an cèill ann an E. coli le toradh deireannach fìor àrd (150 mg/L agus cultaran fras crathadh 256 mg/L airson His-NT-GFP agus His-NT-PNP, fa leth), a rèir na chaidh a shealltainn. airson pròtainean eile ceangailte ri NT Ref.30. Chruthaich pròtanan fusion His-NT-GFP (300mg/mL) agus His-NT-PNP (100mg/mL) gels às deidh 2 uairean agus 6.5 uairean aig 37 ° C agus, gu cudromach, dh’ fhan bloigh GFP gun atharrachadh.air fhaicinn às deidh gelation, le > 70% den chiad dian flùraiseach air fhàgail às deidh gelation (Fig. 6a).Gus gnìomhachd PNP a thomhas anns na fuasglaidhean agus gels-NT-PNP aige, bha againn ri am pròtain fusion a chaolachadh le NT oir bha gnìomhachd enzymatic an ullachaidh fhìor taobh a-muigh raon lorg an assay aig dùmhlachdan gelling.Ghlèidh an gel a chaidh a chruthachadh le measgachadh anns an robh 0.01 mg/mL His-NT-PNP agus 100 mg/mL NT 65% de ghnìomhachd enzymatic tùsail nan sampallan ro-ghoirte (Fig. 6b).Dh'fhuirich an gel slàn rè an tomhais (Fig. 10 Leasachail).
dian fluorescence coimeasach ro agus às deidh gelation de His-NT-GFP (300 mg / mL) agus vial inverted anns a bheil hydrogel His-NT-GFP (300 mg / mL) fo sholas faicsinneach agus UV.Bidh puingean a’ sealltainn tomhasan fa leth (n = 3), tha bàraichean mearachd a’ sealltainn claonadh àbhaisteach.Tha an luach cuibheasach air a shealltainn ann am meadhan nam bàraichean mearachd.b Chaidh gnìomhachd PNP fhaighinn le mion-sgrùdadh fluorometric a’ cleachdadh fuasglaidhean agus gels anns a bheil NT (100 mg / ml) agus measgachadh anns a bheil 0.01 mg / ml his-NT-PNP agus 100 mg / ml New Taiwan dollars.Tha an inset a’ sealltainn vial inverted anns a bheil hydrogel anns a bheil His-NT-PNP (bàr sgèile 5 mm).
An seo, bidh sinn ag aithris gun deach hydrogels a chruthachadh bho NT agus pròtanan spidroin ath-chuingealaichte eile le bhith a’ toirt a-steach fuasgladh pròtain aig 37 ° C (Figear 1).Tha sinn a 'sealltainn gu bheil gelation co-cheangailte ri cruth-atharrachadh α-helices gu β-sreathan agus cruthachadh fibrilean coltach ri amyloid (Figs. 3 agus 4).Tha an lorg seo na iongnadh leis gu bheil NTn nam pasganan globular còig-helix coiled a tha aithnichte airson an sùbailteachd fìor àrd agus seasmhachd àrd aig dùmhlachdan> 200 mg / mL aig 4 ° C airson grunn làithean27.A bharrachd air an sin, bidh NTn a’ pilleadh gu furasta às deidh dì-nàdarachadh teas aig dùmhlachdan pròtain ìosal ann an µM.A rèir ar toraidhean, feumaidh cruthachadh fibril measgachadh de> 10 mg / mL dùmhlachd pròtain agus teòthachd beagan àrdaichte (Fig. 1).Tha seo co-chòrdail ris a’ bheachd gum faod fibrilean amyloid a bhith air an cruthachadh bho phròtainean a tha air am pasgadh gu cruinne agus a tha ann am pàirt gun fhilleadh mar thoradh air caochlaidhean teirmeach fo chumhachan fiosaigeach 48 .Tha eisimpleirean de phròtainean a tha a’ faighinn an tionndaidh seo a’ toirt a-steach insulin49,50, β2-microglobulin, transthyretin agus lysozyme51,52,53.Ged a tha NT na α-helix anns an stàit dhùthchasach aige, tha timcheall air 65% den t-sreath polypeptide co-chòrdail ri cruthachadh zipper steric (Fig. 4e) 45 .Leis gu bheil am monomer gluasadach gu fiùghantach46, faodaidh e na roinnean amyloidogenic a dh’fhaodadh a bhith ann a nochdadh aig teòthachd meadhanach àrd agus aig dùmhlachdan àrda de phròtain iomlan faodaidh e dùmhlachd riatanach a ruighinn airson cruthachadh fibril amyloid54.Às deidh an reusanachadh seo, lorg sinn co-dhàimh àicheil eadar dùmhlachd spidroin agus ùine gelation (Fig. 1c), agus ma tha an co-chòrdadh monomeric NT air a dhèanamh seasmhach an dàrna cuid le mùthaidhean (NT *, His-NT-L6) no le cur-ris salainn, faodaidh e casg a chuir air. cruthachadh hydrogels (Fig. 5).
Anns a 'mhòr-chuid de chùisean, bidh fibrilean amyloid a' dol à sealladh mar fhuasgladh, ach fo chumhachan sònraichte faodaidh iad hydrogels55,56,57 a chruthachadh.Mar as trice tha co-mheas àrd de shealladh aig fibrilean a tha a’ cruthachadh hidrogel agus bidh iad a’ cruthachadh lìonraidhean trì-thaobhach seasmhach tro cheangal moileciuil,55,58 a rèir ar toraidhean.Airson cruthachadh hydrogel in vitro, bidh pròtanan gu tric air am fosgladh gu h-iomlan no ann am pàirt, mar eisimpleir, le bhith fosgailte do fhuasglaidhean organach, teòthachd àrd (70-90 ° C) agus / no pH ìosal (1.5-3.0) 59,60,61,62.Chan fheum na spidroin hydrogels a tha air am mìneachadh an seo giollachd cruaidh, agus chan fheum iad riochdairean tar-cheangail gus na hydrogels a dhèanamh seasmhach.
Chaidh aithris roimhe seo gu bheil ath-aithris spidroin agus QDs, a tha coltach gu bheil iad a’ dol tro atharrachadh β-duilleag aig àm snìomh sìoda, a’ cruthachadh hidrogels.An coimeas ris na co-dhùnaidhean againn, bha amannan goir agus / no teòthachd goir mòran nas fhaide no nas àirde, fa leth, agus bha na hidrogels a thàinig às a sin gu tric neo-shoilleir (Figear 7 agus Clàr Leasachail 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. A bharrachd air amannan gel luath, rinn hydrogels NT> 300 mg / mL (30%) nas fheàrr na a h-uile hydrogels pròtain sìoda damhain-allaidh ath-leasaichte eile a chaidh a mhìneachadh, a bharrachd air hydrogels nàdurrach leithid gelatin, alginate (2%), agar (0.5% ) agus collagen.(0.6%) (Figear 7 agus Clàran Leasachail 1 agus 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Chaidh an ùine gel agus modulus elastagach nan hydrogels san sgrùdadh seo a choimeas ri hydrogels eile stèidhichte air spidroin agus hydrogels nàdarra taghte.Tha iomraidhean air an toirt seachad còmhla ri tuairisgeul air na suidheachaidhean gelation.APS Ammonium persulfate, teòthachd an t-seòmair.Dàta 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Tha e coltach gu bheil damhain-allaidh air dòighean a leasachadh gus casg a chuir air spidroin bho bhith a’ gleusadh aig àm stòraidh.A dh 'aindeoin an ìre àrd de phròtain anns a' ghland sìoda, tha an roinn ath-chuairteachaidh mòr co-cheangailte ris an àrainn crìche a 'ciallachadh gu bheil an ìre de NT agus CT a rèir coltais anns a' ghland a 'freagairt ri timcheall air 10-20 mg / ml, aig crìoch an sgrùdaidh seo.Tha feum air airson cruthachadh hydrogel in vitro.A thuilleadh air an sin, bha co-chruinneachaidhean salainn 16 a 'daingneachadh NT, mar ann an glands sìoda (Fig. 5b).Chaidh co-chòrdadh NT a sgrùdadh anns an E. coli cytosol agus chaidh a lorg gu robh e air a fhilleadh nas teann na nuair a chaidh a sgrùdadh in vitro, a’ nochdadh tuilleadh gu bheil salann no factaran eile a’ cur casg air a bhith air a chruinneachadh ann am vivo.Ach, dh’ fhaodadh comas NTs atharrachadh gu fibrilean duilleag β a bhith cudromach airson cruthachadh filament agus bu chòir sgrùdadh a dhèanamh air ann an sgrùdaidhean san àm ri teachd.
A bharrachd air na taobhan ùra de chruthachadh fibril agus hydrogel coltach ri NT-amyloid a chaidh fhaicinn san sgrùdadh seo, tha sinn cuideachd a’ sealltainn gum faodadh tagraidhean bith-theicneòlas agus bith-mheidigeach a bhith aig an iongantas seo (Fig. 8).Mar dhearbhadh air bun-bheachd, chuir sinn còmhla NT le GFP no PNP agus sheall sinn gu bheil am pròtain fusion cuideachd a’ cruthachadh hidrogels nuair a thèid an goir aig 37 ° C agus gu bheil na bloighean GFP agus PNP gu ìre mhòr a’ cumail an gnìomhachd às deidh gelation (Figear 6).Tha fosphorylases nucleoside nan catalpaichean cudromach ann an synthesis de analogues nucleoside75, a tha a’ dèanamh ar lorg iomchaidh don ghnìomhachas biopharmaceutical.Tha am bun-bheachd de bhith a’ cur an cèill pròtanan fusion a bhios a’ cruthachadh hydrogels follaiseach fo chumhachan fàbharach a’ ceadachadh hydrogels gnìomh a chruthachadh le feartan fàbharach airson raon farsaing de thagraidhean leithid gluasad enzyme, leigeil ma sgaoil dhrogaichean fo smachd agus innleadaireachd clò.A bharrachd air an sin, tha NT agus NT * nan comharran faireachdainn èifeachdach30, a tha a’ ciallachadh gum faodar NT agus na caochlaidhean aige a chleachdadh airson cinneasachadh àrd-thoradh de phròtainean fusion soluble agus cruthachadh pròtanan targaid neo-ghluasadach ann an hydrogels 3D.
Tha NT solubhail, α-helical agus seasmhach aig dùmhlachd ìosal (µM) agus 37 ° C.Aig an aon teòthachd, ach aig àrdachadh co-chruinneachaidhean (> 10 mg / ml), bidh NT a 'cruthachadh gels anns a bheil fibrils coltach ri amyloid.Bidh pròtanan fusion NT cuideachd a’ cruthachadh gels fibrillar le mìrean fusion làn-ghnìomhach, a’ leigeil le diofar phròtainean a bhith air an gluasad ann an hydrogels 3D a’ cleachdadh NT.Gu h-ìosal: NT (PDB: 4FBS) agus dealbhan de lìonraidhean snàithleach agus structaran pròtain co-cheangailte riutha (air an gabhail ris agus gun a bhith air an tarraing gu sgèile, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2).
Chaidh na structaran (faic Clàr Leasachail 4 airson liosta iomlan a' gabhail a-steach sreathan aminoideach) a chlò-bhualadh gu plasmid pT7 agus an cruth-atharrachadh gu E. coli BL21 (DE3).Chaidh E. coli anns an robh plasmids innleadaichte a ghabhail a-steach ann am broth Luria le taic bho kanamycin (70 mg/l) agus fhàs thar oidhche aig 30 ° C agus 250 rpm.Chaidh an cultar an uairsin a thoirt a-steach 1/100 a-steach do mheadhan LB anns an robh kanamycin agus air a chultarach aig 30 ° C agus 110 rpm gus an do ràinig an OD600 0.8.Airson sgrùdaidhean NMR, chaidh bacteria fhàs ann am meadhan beag M9 anns a bheil 2 g de D-glucose 13C (Aldrich) agus 1 g de ammonium chloride 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) airson bileagan pròtain le isotopan.Lùghdaich an teòthachd gu 20 ceum Celsius agus brosnaich abairt pròtain le isopropylthiogalactopyranoside 0.15 mM (cuibhreann deireannach).Às deidh abairt pròtain thar oidhche, chaidh ceallan a bhuain aig 7278 × g, 4 ° C airson 20 min.Chaidh cruinneagan cealla a chuir air ais ann an 20 mM Tris-HCl, pH 8, agus an reothadh gus an tèid an cleachdadh a bharrachd.Chaidh ceallan leaghte a lìomhadh le bhith a’ cleachdadh aimhreit cealla (innealan sreath TS, Constant Systems Limited, Sasainn) aig 30 kPa.An uairsin tha na lysates air an centrifuged aig 25,000 g airson 30 mionaid aig 4 ° C.Airson NTMiSp, chaidh am pellet ath-chuiridh an uairsin ann an 2 M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 8, agus sonicated airson 2 min (2 s air / dheth, 65%), an uairsin centrifuged a-rithist aig 25,000 xg, 4 ° C. 30 mionaid.Chaidh an supernatant a luchdachadh air colbh Ni-NTA, air a nighe le 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8, agus mu dheireadh chaidh am pròtain a chuir air falbh le 20 mM Tris-HCl, imidazole 200 mM, pH 8. Gus NT2RepCT agus NTCT, tha cnàmhadh thrombin a’ toirt a-steach an làrach (ThrCleav) eadar His agus NT.Tha làraichean cleavage thrombin cuideachd an làthair ann an His-NT-ThrCleav-2Rep (a 'dèanamh 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (a' dèanamh NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (a 'dèanamh CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (a ’dèanamh NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (a’ toirt a-mach NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (a ’toirt a-mach NTF1Sp), agus His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (a’ toirt a-mach NTMIp).Chaidh na togalaichean a chnàmh le thrombin (1: 1000) agus an dialyzed thar oidhche aig 4 ° C. le 20 mM Tris-HCl, pH 8, a’ cleachdadh membran dialysis Spectra / Por le stairsneach cuideam moileciuil de 6-8 kDa.Às deidh dialysis, tha am fuasgladh air a luchdachadh air colbh Ni-NTA agus tha an t-uisge anns a bheil am pròtain inntinneach air a chruinneachadh.Chaidh dùmhlachdan pròtain a dhearbhadh le bhith a’ tomhas sùghadh UV aig 280 nm a’ cleachdadh co-èifeachd dol à bith gach pròtain, ach a-mhàin NTF1Sp, a chleachd assay Bradford a rèir protocol an neach-dèanamh.Chaidh purrachd a dhearbhadh le polyacrylamide SDS (4-20%) electrophoresis gel agus staining gorm sgoinneil Coomassie.Bha pròtainean air an cruinneachadh le bhith a’ cleachdadh sìoltachain centrifuge (VivaSpin 20, GE Healthcare) aig 4000 xg le gearradh cuideam moileciuil 10 kDa ann an cearcallan 20 mionaid.
Leudaich am fuasgladh pròtain agus pìob gu faiceallach 150 µl a-steach do vial septum soilleir 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Bha na tiùban air an còmhdachadh agus air an seuladh le parafilm gus casg a chuir air falmhachadh.Chaidh sampaill (n = 3) a bhrosnachadh aig 37 ° C no 60 ° C agus bho àm gu àm air an tionndadh gus sùil a chumail air gelation.Chaidh sampaill nach robh gel a thoirt a-steach airson co-dhiù seachdain.Lùghdaich bannan disulfide NTMiSp le 10 mM DTT gach pròtain 10 µM.Gus sgrùdadh a dhèanamh air gelation còmhdach sìoda damhain-allaidh nàdarra, chaidh an damhan-allaidh drochaid Suaineach a ghearradh, chaidh an dà phrìomh fhaireag meudaichte a chuir ann an 200 μl de 20 mM bufair Tris-HCl pH 8 agus a ghearradh gus leigeil leis a ’chòmhdach dealachadh bho na fàireagan..Tha susbaint na fàireagan air a sgaoileadh ann am bufair, 50 µl airson cuideam tioram a dhearbhadh (le bhith a’ toirt a-steach criathragan fosgailte aig 60 ° C gu cuideam cunbhalach) agus 150 µl airson gelation aig 37 ° C.
Tha an geoimeatraidh / inneal tomhais air a dhèanamh de stàilinn gun staoin a’ cleachdadh truinnsear co-shìnte le trast-thomhas àrd de 20 mm agus beàrn de 0.5 mm.Teas an sampall bho 25 ° C gu 45 ° C agus air ais gu 25 ° C aig ìre 1 ° C gach mionaid a ’cleachdadh truinnsear Peltier bonn stàilinn.Chaidh tomhas crathaidh a dhèanamh aig tricead 0.1 Hz agus ann an roinn loidhneach viscoelastic an stuth aig strain de 5% agus 0.5% airson sampallan de 100 mg / mL agus 300-500 mg / mL, fa leth.Cleachd seòmar taiseachd àbhaisteach gus casg a chuir air falmhachadh.Chaidh dàta a sgrùdadh a’ cleachdadh Prism 9.
Airson a bhith a 'tional speactra infridhearg (IR) aig teòthachd an t-seòmair bho 800 gu 3900 cm-1.Tha an inneal ATR, a bharrachd air an t-slighe solais tron ​​​​speactrometer, air a ghlanadh le èadhar sìolaidh tioram ro agus rè an deuchainn.Chaidh fuasglaidhean (500 mg / mL gus binneanan sùghaidh uisge a lughdachadh anns an speactram) a phìobadh air na criostalan, agus chaidh gels (500 mg / mL) a chruthachadh mus deach an tomhas agus an uairsin a ghluasad gu na criostalan (n = 3).Chaidh 1000 sganadh a chlàradh le rùn de 2 cm-1 agus cearcall dleastanais neoni de 2. Chaidh an dàrna toradh a thomhas a’ cleachdadh OPUS (Bruker) a’ cleachdadh raon rèidh de naoi puingean.Chaidh na speactra a dhèanamh àbhaisteach dhan aon roinn amalachaidh eadar 1720 agus 1580 cm-1 a’ cleachdadh F. Menges “Spectragryph – Optical Spectroscopy Software”.Ann an speactroscopaidh ATR-IR, tha doimhneachd treòrachaidh beam infridhearg a-steach do shampall an urra ri àireamh tonn, a’ leantainn gu in-ghabhail nas làidire aig àireamhan tonn nas ìsle na aig àireamhan tonn nas àirde.Cha deach na buaidhean sin a cheartachadh airson an speactram a chithear ann am Figs.3 oir tha iad glè bheag (Fig. 4 a bharrachd).Chaidh speactra ceartaichte airson an fhigear seo a thomhas a’ cleachdadh bathar-bog Bruker OPUS.
Ann am prionnsapal, tha e comasach àireamhachadh coileanta de cho-chòrdalachd pròtain às deidh dì-riaghladh earbsach de na pàirtean taobh a-staigh stùc amide I.Ach, tha cuid de chnapan-starra ag èirigh ann an cleachdadh.Faodaidh fuaim san speactram nochdadh mar stùcan (meallta) aig àm dì-chonnachaidh.A bharrachd air an sin, tha an stùc mar thoradh air lùbadh uisge a’ dol aig an aon àm ri suidheachadh stùc amide I agus dh’ fhaodadh gum bi an aon mheud ann airson sampallan anns a bheil tòrr uisge, leithid an gel uisgeach a chaidh a sgrùdadh an seo.Mar sin, cha do dh’ fheuch sinn ri stùc amide I a sgrios gu tur, agus cha bu chòir beachdachadh air na beachdan againn ach mar thaic do dhòighean eile leithid speactroscopaidh NMR.
Chaidh fuasglaidhean de 50 mg / ml NT agus His-NT2RepCT a ghleusadh thar oidhche aig 37 ° C.Chaidh an hydrogel an uairsin a lagachadh le 20 mM Tris-HCl (pH 8) gu dùmhlachd de 12.5 mg / ml, air a chrathadh gu math agus air a phìobadh gus an gel a bhriseadh.An uairsin, chaidh an hydrogel a lagachadh 10 tursan le 20 mM Tris-HCl (pH 8), chaidh 5 μl den sampall a chuir an sàs ann an cliath copair còmhdaichte le formvar, agus chaidh an sampall a bharrachd a thoirt air falbh le pàipear sèididh.Chaidh sampaill a nighe dà uair le 5 µl de uisge MilliQ agus a dhath le cruth uranyl 1% airson 5 mionaidean.Thoir air falbh cus stain le pàipear sùghaidh, an uairsin tiormaich am mogal.Chaidh ìomhaighean a dhèanamh air na cliathan sin a’ cleachdadh FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN ag obair aig 100 kV.Chaidh na h-ìomhaighean a chlàradh aig x 26,500 agus x 43,000 meudachaidhean a’ cleachdadh camara Veleta 2k × 2k CCD (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, A’ Ghearmailt).Airson gach sampall (n = 1), chaidh 10-15 ìomhaigh a chlàradh.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) air a chleachdadh airson mion-sgrùdadh ìomhaighean agus tomhas trast-thomhas fiber (n = 100, diofar snàithleach).Chaidh Prism 9 a chleachdadh gus deuchainnean-t gun chàraid (dà-earball) a dhèanamh.B ’e na fibrils cuibheasach His-NT2RepCT agus NT 11.43 (SD 2.035) agus 7.67 (SD 1.389) nm, fa leth.Is e an eadar-àm misneachd (95%) -4.246 gu -3.275.ìrean saorsa = 198, p <0.0001.
Chaidh 80 µl de shamhlaichean leaghaidh anns an robh 10 µM thioflavin T (ThT) a thomhas ann an trì-fhillte (n = 3) fo chumhachan statach a’ cleachdadh truinnsearan bun soilleir Corning 96-tobar dubh (Corning Glass 3881, USA).Chaidh eadar-dhealachaidhean fluorescence a chlàradh a’ cleachdadh criathrag excitation 440 nm agus sìoltachan sgaoilidh 480 nm (FLUOStar Galaxy bho BMG Labtech, Offenburg, a’ Ghearmailt).Cha robh an comharra ThT air a shàthachadh no air a chuir às, oir chaidh deuchainnean le diofar cho-chruinneachaidhean de ThT a dhèanamh gun a bhith ag atharrachadh dian nan comharran.Clàraich sùghadh aig 360 nm airson tomhas ceò.Airson deuchainnean sìolachaidh, chaidh gels 100 mg / mL a chruthachadh aig 37 ° C., ath-chuairteachadh, agus an cleachdadh airson sìolachadh aig co-mheasan molar de 5%, 10%, agus 20%.Chaidh dàta a sgrùdadh a’ cleachdadh Prism 9.
Thoir stocan de His-NT2RepCT agus NT> 100 mg / mL air deigh agus sìoladh tro shìoltachan 0.22 µm.Chaidh dùmhlachdan a thomhas le bhith a’ tomhas sùghaidh aig 280 nm a’ cleachdadh Nanodrop.Ann an tobraichean de phlàta neo-cheangail dubh 96-tobar (Corning) le bonn soilleir, chaidh sampallan a lagachadh gu 20 mg / ml ann an 20 mM Tris-HCl pH 8 agus measgachadh le 5 μM ThT (cuibhreann deireannach), dùmhlachd sampall iomlan tomhas-lìonaidh 50 μl.Chaidh sampaill a dhealbhadh gach 10 mionaid aig 37 ° C air miocroscop CellObserver (Zeiss) le sianal solais tar-chuir agus seataichean sìoltachain sgaoilidh is sgaoilidhean FITC airson ìomhaighean ThT.Tha lionsa 20x/0.4 air a chleachdadh airson ìomhaighean.Chaidh Zen Blue (Zeiss) agus ImageJ (https://imagej.nih.gov/) a chleachdadh airson mion-sgrùdadh ìomhaighean.Chaidh gels ullachadh cuideachd bho fhuasglaidhean NT agus His-NT2RepCT aig dùmhlachd de 50 mg / mL anns a bheil 20 mM Tris pH 8 agus 5 µM ThT agus air an goir aig 37 ° C airson 90 min.Chaidh na pìosan gel a ghluasad gu tobar ùr anns an robh 20 mM Tris, pH 8, agus 5 μM ThT ann am plàta bonn dubh neo-cheangailteach 96 gu math soilleir.Faigh fluorescence uaine agus ìomhaighean soilleir achaidh aig meudachadh 20x / 0.4.Chaidh ImageJ a chleachdadh airson mion-sgrùdadh ìomhaighean.
Chaidh speactra NMR fuasgladh fhaighinn aig 310 K air speactrometer Bruker Avance Neo 600 MHz uidheamaichte le Cryoprobe Achaidh Caisead Quadrupole Resonance Pulsed Gradient (HFCN) QCI.Sampaill NMR anns a bheil pròtain aon-ghnèitheach 10 mg / mL air a chomharrachadh le 13C, 15N, air a sgaoileadh ann an 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w / v) NaN3, 5% DO (v / v), (n = 1) .Chaidh gluasadan ceimigeach de NT2RepCT aig pH 6.7 a chleachdadh gus stùc 23 a shònrachadh anns an speactram 2D ​​de 15N-HSQC.
Chaidh speactra cruaidh snìomh ceàrn draoidheil NMR (MAS) de 13C, hydrogels le bileag 15N a chlàradh air spectrometer Bruker Avance III HD aig 800 MHz uidheamaichte le probe gun dealan 3.2 mm 13C / 15N{1H}.Chaidh smachd a chumail air teòthachd sampall le bhith a’ cleachdadh sruth gas teòthachd caochlaideach aig 277 K. Fhuaireadh ath-shuidheachadh cuairteachaidh dipole dà-thaobhach (DARR)76 agus ath-cheangal tricead rèidio (RFDR) 77 aig triceadan MAS de 12.5 kHz agus 20 kHz, fa leth.Chaidh tar-polarachadh (CP) bho 1H gu 13C a dhèanamh a’ cleachdadh rampa sreathach bho 60.0 gu 48.0 kHz aig 1H, 61.3 / 71.6 kHz aig 13C (aig 12.5 / 20 kHz MAS) agus ùine conaltraidh 0.5–1 ms.Chaidh dì-cheangal spinal6478 aig 73.5 kHz a chleachdadh aig àm cruinneachadh dàta.B’ e an ùine togail 10 milliseconds agus b’ e an dàil rothaireachd 2.5 diogan.Chaidh na co-dhàimhean Cα / Cβ aon-cheangailte a chaidh fhaicinn anns an speactram RFDR a shònrachadh a rèir gluasadan ceimigeach seòrsa fuigheall àbhaisteach agus co-dhàimhean ioma-cheangailte anns an speactra DARR.
Chaidh an stòr-dàta Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) a chleachdadh gus gluasadan flutter agus lùth Rosetta a mheasadh airson NT, NTFlSp, agus NTMiSp.Bidh an stòr-dàta Zipper a’ cunntadh Rosetta Energy80, a bhios a’ cothlamadh grunn ghnìomhan lùtha an-asgaidh gus structar pròtain a mhodaladh agus a sgrùdadh.Tha ìre lùtha de -23 kcal/mol no nas ìsle na chomharradh àrd buailteachd fibrillate.Tha an lùth as ìsle a 'ciallachadh barrachd seasmhachd an dà shreath β ann an co-chòrdadh an zipper.A bharrachd air an sin, chaidh algorithm Waltz a chleachdadh gus roinnean amyloidogenic a ro-innse ann an NT, NTFlSp agus NTMiSp Ref.81. ( https://waltz.switchlab.org/ ).
Chaidh fuasgladh pròtain NT a mheasgachadh le bufair 2-(N-morpholino) searbhag ethanesulfonic (MES) aig pH 5.5 agus 6.0 gus am pH a lughdachadh gu pH 6 agus 7, fa leth.B’ e an ìre mu dheireadh de phròtain 100 mg/ml.
Chaidh tomhasan a dhèanamh air spectrometer CD J-1500 (JASCO, USA) a’ cleachdadh cuvette 300 μL le slighe optigeach de 0.1 cm.Chaidh pròtainean a lagachadh gu 10 μM (n = 1) ann am bufair fosfáit 20 mM (pH 8).Gus sgrùdadh a dhèanamh air seasmhachd pròtain ann an làthaireachd salainn, chaidh pròtanan a sgrùdadh aig an aon dùmhlachd (n = 1) ann am bufair fosfáit 20 mM (pH 8) anns an robh 154 mM NaF no NaCl, fa leth.Chaidh sganaidhean teodhachd a chlàradh aig 222 nm bho 25 ° C gu 95 ° C le ìre teasachaidh de 1 ° C / min.Chaidh a’ chuibhreann de phròtainean fillte dùthchasach a thomhas a’ cleachdadh na foirmle (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).A bharrachd air an sin, chaidh còig speactram a chlàradh airson gach sampall bho 260 nm gu 190 nm aig 25 ° C agus às deidh teasachadh gu 95 ° C.Chaidh còig speactra a chuibheasachadh, a ghluasad agus atharrachadh gu ellipticity molar.Chaidh dàta a sgrùdadh a’ cleachdadh Prism 9.
Chaidh dian fluorescence His-NT-GFP (300 mg / mL, 80 µL) a thomhas ann an trì-fhillte (n = 3) ann am pleitean Corning 96-tobar le bonn dubh follaiseach (Corning Glass 3881, USA) fo chumhachan statach.Tomhais sampallan le leughadair truinnsear stèidhichte air fluorescence le tonn-tonn excitation de 395 nm agus clàraich an sgaoileadh aig 509 nm ro gelation agus 2 uair às deidh sin aig 37 ° C.Chaidh dàta a sgrùdadh le Prism 9.
Chaidh pasgan measaidh gnìomhachd purine nucleoside phosphorylase (modh fluorometric, Sigma Aldrich) a chleachdadh a rèir stiùireadh an neach-dèanamh.Gus gnìomhachd ann an gels agus fuasglaidhean anns a bheil His-NT-PNP a thomhas, measgachadh 10 ng de His-NT-PNP le 100 mg / mL NT gu tomhas-lìonaidh iomlan de 2 µL oir thug an gel comharra os cionn an ùine lorgaidh den t-seata.Chaidh smachdan airson gels agus fuasglaidhean às aonais His-NT-PNP a thoirt a-steach.Chaidh na tomhais a dhèanamh dà uair (n = 2).Às deidh a ’ghnìomhachd a thomhas, chaidh am measgachadh ath-bhualadh a thoirt air falbh agus chaidh dealbh a thogail den gel gus dèanamh cinnteach gum fuirich an gel slàn rè an tomhais.Chaidh dàta a sgrùdadh a’ cleachdadh Prism 9.
Airson tuilleadh fiosrachaidh mu dhealbhadh sgrùdaidh, faic an geàrr-chunntas sgrùdadh nàdair ceangailte ris an artaigil seo.
Tha figearan 1 agus 2 a’ taisbeanadh an dàta tùsail.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, agus 6, Figean Leasachail.3, figear a bharrachd.5a, d, fig leasachail.6 agus figear a bharrachd.8. Dàta Dàta bhon sgrùdadh seo air aoigheachd ann an stòr-dàta Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Chaidh an dàta NMR a fhuaireadh san sgrùdadh seo a phostadh gu stòr BMRBig fon ID inntrigidh bmrbig36.Chaidh structaran GFP agus PNP a thoirt bho PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Ag èirigh, A. agus Johansson, J. A’ snìomh sìoda damhain-allaidh fuadain.Ceimigeach nàiseanta.bith-eòlas.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Tha an genoma Nephila clavipes a’ soilleireachadh an iomadachd de ghinean sìoda damhain-allaidh agus am faireachdainn iom-fhillte.Genette Nàiseanta.49, 895–903 (2017).