347 12.7 * 1.24mm Tiùban coiled stàilinn gun staoin, Uidheam moileciuil de cho-chòrdadh electrostatach sioncronaich agus co-chruinneachadh de α-synuclein agus tau

Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com.Tha thu a’ cleachdadh dreach brobhsair le taic CSS cuibhrichte.Airson an eòlas as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu brobhsair ùraichte (no cuir à comas Modh Co-chòrdalachd ann an Internet Explorer).A bharrachd air an sin, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, bidh sinn a 'sealltainn an làrach gun stoidhlichean agus JavaScript.
Sleamhnagan a’ sealltainn trì artaigilean gach sleamhnag.Cleachd na putanan air ais is air adhart gus gluasad tro na sleamhnagan, no na putanan rianadair sleamhnag aig an deireadh gus gluasad tro gach sleamhnag.

347 Sònrachadh Pìoba Stàilinn

347 12.7 * 1.24mm Tiùban coiled stàilinn gun staoin

Trast-thomhas taobh a-muigh: 6.00 mm OD suas gu 914.4 mm OD, Meudan suas gu 24 ″ NB ri fhaighinn Ex-stoc, Tiùban Stàilinn Meud OD ri fhaighinn Ex-stoc

Raon tiugh pìoba SS 347: 0.3mm - 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, msaa (0.5-12mm) No meud neo-riaghailteach ri dhèanamh freagarrach mar a dh’ fheumar

Seòrsa: SS 347 Pìoban gun ròin |SS 347 Pìoban ERW |SS 347 Pìoban tàthaichte |SS 347 Pìoban dèanta |Tiùban SS 347 CDW, pìoban LSAW / tàthadh seam / ath-tharraing

Foirm: SS 347 Pìoban / Tiùban Cruinn, SS 347 Pìoba / Tiùban ceàrnagach, SS 347 Pìoba / Tiùban ceart-cheàrnach, SS 347 Tiùban Coiled, Cumadh SS 347 “U”, SS 347 Coil Cèic Pan, SS 347 Tiùban Hydraulic

Fad: Singilte air thuaiream, Random Dùbailte & Ceann Faid riatanach: Deireadh Soilleir, Deireadh Beveled, Treaded

Dìon Crìoch: Ceapan plastaig |Crìoch taobh a-muigh: 2B, Àir.4, Àir.1, Àir.8 Sgàthan Crìochnachaidh airson Pìoban Stàilinn, Crìochnaich a rèir riatanasan teachdaiche

Suidheachadh Lìbhrigeadh: Annealed agus Pickled, Snasail, Bright Annealed, Fuar air a tharraing

Sgrùdadh, Aithisgean Deuchainn: Teisteanasan Deuchainn Muilne, EN 10204 3.1, Aithisgean Ceimigeach, Aithisgean Meacanaigeach, Aithisgean Deuchainn PMI, Aithisgean Sgrùdaidh Lèirsinneach, Aithisgean Sgrùdaidh Treas Pàrtaidh, Aithisgean Lab aontaichte le NABL, Aithisg Deuchainn millteach, Aithisgean Deuchainn Neo-sgriosail

Pacadh: Pacadh ann am bogsaichean fiodha, pocannan plastaig, stiallan stàilinn air an cruinneachadh, no a rèir iarrtasan teachdaiche

Sònraichte: Faodar meudan agus sònrachaidhean a bharrachd air gu h-àrd a dhèanamh ma thèid an iarraidh

Raon meud pìoba SS 347: 1/2 òirleach NB, OD gu 24 òirleach

ASTM A312 347: Pìoba austenitic tàthaichte le seam dìreach agus dìreach airson teòthachd àrd agus seirbheis creimneach coitcheann.Chan eil meatailt lìonaidh ceadaichte aig àm tàthaidh.

ASTM A358 347: Pìoba austenitic tàthaichte le fusion dealain airson seirbheis creimneach agus / no teòthachd àrd.Mar as trice chan eil ach pìob suas ri 8 òirleach air a thoirt a-mach a rèir an t-sònrachadh seo.Tha e ceadaichte meatailt lìonaidh a chur ris aig àm tàthaidh.

ASTM A790 347: Pìoba ferritic / austenitic tàthaichte le tàthadh dìreach agus dìreach airson seirbheis creimneach coitcheann, le cuideam sònraichte air a bhith an aghaidh sgàineadh creimeadh cuideam.

ASTM A409 347: Pìoba balla-solais austenitic trast-thomhas mòr air a thàthadh ann am meudan 14 ”gu 30” le ballachan Sch5S agus Sch 10S airson creimneach agus / no àrd

ASTM A376 347: Pìoba austenitic gun ròin airson tagraidhean teòthachd àrd.

ASTM A813 347: Pìoba austenitic le tàthadh singilte, singilte no dùbailte airson teòthachd àrd agus tagraidhean creimneach coitcheann.

ASTM A814 347: Pìoba austenitic tàthaichte fuar-obrach airson teòthachd àrd agus seirbheis creimneach coitcheann.

347H Pìoban Stàilinn Co-dhèanamh Ceimigeach

Feartan meacanaigeach pìoban stàilinn 347H

Stàilinn stainless 347H pìoban feartan corporra

Ìrean Co-ionann airson Pìoba Stàilinn 347H

Tha cruinneachadh amyloid alpha-synuclein (αS) na chomharradh air galar Pharkinson agus synucleinopathies eile.O chionn ghoirid, tha am pròtain tau a tha gu cumanta co-cheangailte ri galar Alzheimer air a bhith co-cheangailte ri pathology αS agus chaidh a lorg gu bhith a ’co-shuidheachadh ann an in-ghabhail beairteach αS, ged a tha an dòigh moileciuil airson co-chruinneachadh an dà phròtain fhathast neo-shoilleir.Tha sinn ag aithris an seo gu bheil an ìre αS a ’sgaradh a-steach do cho-chòrdadh leaghan tro cho-chòrdadh iom-fhillte electrostatach le polypeptides le deagh chasaid leithid tau.A rèir an dàimh a th’ aig αS airson polycations agus an ìre de ìsleachadh valence den lìonra coagulation, bidh clots a’ dol tro gheiltachadh luath no co-aonadh agus an uairsin cruinneachadh slaodach amyloid.Le bhith a’ cothlamadh sreath de dhòighean adhartach bith-fhiosaigeach, bha e comasach dhuinn an sgaradh ìre αS/Tau leachtach-liquid a chomharrachadh agus na prìomh nithean a chomharrachadh a lean gu cruthachadh cruinneachaidhean heterogeneous anns a bheil an dà phròtain ann an co-chòrdadh pròtain leaghaidh.
A bharrachd air cuibhreannan membran, faodar sgaradh spàsail ann an ceallan a choileanadh cuideachd le bhith a’ cruthachadh buidhnean tiugh làn pròtain, coltach ri lionn ris an canar co-dhlùthaidhean bith-mholacileach no boinneagan, tro phròiseas ris an canar dealachadh ìre lionn-leaghaidh (LLPS).Tha na boinneagan sin air an cruthachadh le eadar-obrachaidhean ùineail ioma-fhillte, mar as trice eadar pròtanan no pròtanan agus RNA, agus bidh iad a’ frithealadh grunn ghnìomhan anns cha mhòr a h-uile siostam beò.Tha àireamh mhòr de phròtainean comasach air LLP a’ taisbeanadh sreathan de dh’ iom-fhillteachd ìosal a tha gu math mì-rianail ann an nàdar agus ann a bhith a’ cruthachadh co-dhlùthan bith-mholacileach3,4,5.Tha grunn sgrùdaidhean deuchainneach air nochdadh nàdar sùbailte, gu tric mì-rianail, agus ioma-fhillte nam pròtanan a tha a’ dèanamh suas na co-dhlùthaidhean coltach ri leaghan sin, ged nach eil mòran fios againn mu na co-dhùnaidhean moileciuil sònraichte a bhios a’ cumail smachd air fàs agus aibidh nan co-dhlùthan sin gu ìre nas cruaidhe. stàite..
Tha an dàta ùr a’ toirt taic don bharail gum faodadh LLPS neo-sheasmhach air a stiùireadh le pròtain agus cruth-atharrachadh boinneagan gu structaran cruaidh a bhith nan slighean cealla iomchaidh a dh’ adhbhraicheas cruthachadh cruinneachaidhean puinnseanta do-fhuasgladh a tha gu tric nan comharran de ghalaran degenerative.Tha mòran de phròtainean le eas-òrdugh gnèitheach (IDPan) co-cheangailte ri LLPS, gu tric fo uallach mòr agus sùbailte, air a bhith co-cheangailte o chionn fhada ri neurodegeneration tro phròiseas cruinneachadh amyloid.Gu sònraichte, thathas air sealltainn gu bheil co-chòrdadh IDP biomolecular leithid FUS7 no TDP-438 no pròtanan le raointean mòra iom-fhillteachd ìosal leithid hnRNPA19 a ’fàs nas sine ann an cruth gel no eadhon cruth cruaidh tro phròiseas ris an canar fluidization.cumadh.gu eadar-ghluasad ìre cruaidh (LSPT) mar ghnìomh ùine no mar fhreagairt air cuid de dh’ atharrachaidhean iar-eadar-theangachaidh no mùthaidhean a tha cudromach gu pathological1,7.
Is e IDP eile co-cheangailte ri LLPS in vivo Tau, pròtain eas-òrdugh co-cheangailte ri microtubule aig a bheil cruinneachadh amyloid air a bhith an sàs ann an galar Alzheimer10 ach a tha cuideachd air a bhith an sàs o chionn ghoirid ann an galar Pharkinson (PD) agus proteinopathies niùclasach synaptic eile 11, 12, 13 co-cheangailte.Thathas air sealltainn gu bheil Tau a’ dealachadh gu neo-iomchaidh bho fhuasgladh / cytoplasm mar thoradh air eadar-obrachaidhean electrostatach fàbharach14, a’ leantainn gu cruthachadh boinneagan le beairteas tau ris an canar coacervates electrostatach.Chaidh a thoirt fa-near cuideachd gur e an seòrsa seo de eadar-obrachadh neo-shònraichte am feachd a tha air cùl mòran de cho-chòrdadh bith-mholacileach ann an nàdar15.Ann an cùis pròtain tau, faodar cruinneachadh electrostatach a chruthachadh le cruinneachadh sìmplidh, anns am bi roinnean den phròtain a tha fo chasaid mu choinneamh a’ brosnachadh a’ phròiseas glanaidh, no le cruinneachadh iom-fhillte tro eadar-obrachadh le polymers le droch uallach leithid RNA.
O chionn ghoirid, chaidh α-synuclein (αS), IDP amyloid a tha an sàs ann am PD agus galairean neurodegenerative eile ris an canar synucleinopathy17,18, a nochdadh ann am modalan ceallach is beathach19,20 stèidhichte ann am pròtain co-chòrdadh le giùlan coltach ri lionn.Tha sgrùdaidhean in vitro air sealltainn gu bheil αS a’ dol tro LLPS le cruinneachadh sìmplidh tro eadar-obrachaidhean hydrophobic sa mhòr-chuid, ged a tha feum aig a’ phròiseas seo air dùmhlachdan pròtain air leth àrd agus amannan brosnachaidh fada neo-àbhaisteach19,21.Tha co-dhiù a bheil na co-dhlùthan anns a bheil αS a chaidh an sgrùdadh ann am vivo air an cruthachadh leis a' phròiseas LLPS seo no ann an dòigh eile fhathast na phrìomh chùis gun fhuasgladh.Mar an ceudna, ged a chaidh co-chruinneachadh αS amyloid fhaicinn ann an neurons ann am PD agus synucleinopathies eile, chan eil an dearbh dhòigh anns am bi αS a ’dol tro cho-chruinneachadh amyloid intracellular fhathast soilleir, leis nach eil coltas ann gu bheil cus cuideam den phròtain seo a’ brosnachadh a ’phròiseas seo leis fhèin.Tha feum air milleadh cealla a bharrachd gu tric, a’ moladh gu bheil feum air àiteachan cealla sònraichte no meanbh-àrainneachdan airson ath-nuadhachadh co-chruinneachaidhean amyloid αS intracellular.Is dòcha gur e aon àrainneachd ceallach a tha gu sònraichte buailteach a bhith a’ cruinneachadh an taobh a-staigh de cho-dhlùthan pròtain 23 .
Gu h-inntinneach, chaidh a lorg gu bheil αS agus tau a’ co-roinn ann an in-ghabhail ghalaran àbhaisteach ann an daoine le galar Pharkinson agus synucleinopathies 24,25 eile agus tha deuchainnean air aithris gu bheil dàimh pathological synergistic eadar an dà phròtain 26,27 a’ moladh dàimh a dh’ fhaodadh a bhith ann eadar cruinneachadh αS agus Tau ann an galaran neurodegenerative.tinneas.Thathas air faighinn a-mach gu bheil αS agus tau ag eadar-obrachadh agus ag adhartachadh cruinneachadh a chèile in vitro agus in vivo 28,29 agus chaidh co-chruinneachaidhean heterogeneous a chaidh a dhèanamh den dà phròtain sin fhaicinn ann an eanchainn euslaintich le synucleinopathies 30.Ach, chan eil mòran fios againn mu bhunait moileciuil an eadar-obrachaidh eadar αS agus tau agus an dòigh anns a bheil a cho-chruinneachadh.Thathas ag aithris gu bheil αS ag eadar-obrachadh le tau tro tharraing electrostatach eadar an roinn C-terminal de αS le uallach àicheil agus an roinn tau sa mheadhan làn proline, a tha cuideachd air a bheairteachadh ann am fuigheall le cosgais dearbhach.
Anns an sgrùdadh seo, tha sinn a’ sealltainn gum faod αS gu dearbh a dhol an sàs ann an boinneagan tro cho-dhlùthadh iom-fhillte electrostatach an làthair pròtain tau, an taca ris an eadar-obrachadh le polypeptides eile le deagh chasaid leithid poly-L-lysine (pLK), agus sa phròiseas seo .Tha αS ag obair mar mholacile sgafallachd airson an lìonra droplet.Tha sinn air eadar-dhealachaidhean follaiseach a chomharrachadh ann am pròiseas aibidh coacervates αS electrostatach, a tha co-cheangailte ri eadar-dhealachaidhean ann an valency agus neart eadar-obrachadh phròtainean a tha an sàs anns an lìonra coacervate.Gu inntinneach, chunnaic sinn co-chruinneachadh de phròtainean αS agus tau amyloid ann an coacervates leaghaidh fad-ùine agus chomharraich sinn cuid de phrìomh nithean a tha a’ leantainn gu co-chruinneachadh den dà phròtain sin ann an coacervates mar sin.An seo tha sinn a’ toirt cunntas mionaideach air a’ phròiseas seo, a tha na inneal moileciuil a dh’ fhaodadh a bhith mar bhunait air colocalization dà phròtain ann an in-ghabhail a tha sònraichte do ghalaran.
Tha earball C-terminal fìor anionic aig αS aig pH neodrach (Fig. 1a), agus bha sinn a’ smaoineachadh gum faodadh e a dhol tro LLPS tro cho-chòrdadh iom-fhilltean electrostatach le moileciuilean polypeptide eas-òrdugh polycationic.Chleachd sinn poly-L-lysine 100-fuigheall (pLK) mar am moileciuil modail tòiseachaidh air sgàth a nàdar polymeric le uallach dearbhach agus mì-rianail aig pH neodrach 32. An toiseach, dhearbh sinn gu bheil pLK ag eadar-obrachadh le raon Ct de αS tro Solution NMR speactroscopaidh. (Figear 1b) a’ cleachdadh 13C / 15N-label αS an làthair co-mheasan molar αS: pLK a tha a’ sìor fhàs.Tha eadar-obrachadh pLK leis an Ct-domain de αS ga nochdadh fhèin ann an draghan den ghluasad cheimigeach agus lùghdachadh anns an ìre dian as àirde san roinn seo den phròtain.Gu inntinneach, nuair a mheasg sinn αS le pLK aig dùmhlachd αS de mu.5–25 µM an làthair polyethylene glycol (5–15% PEG-8) (bufair LLPS àbhaisteach: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) chaidh sinn sa bhad tro raon farsaing de chruthachadh pròtain .chaidh boinneagan fhaicinn a’ cleachdadh fluorescence (WF) agus miocroscop achadh soilleir (BF) (Fig. 1c).boinneagan 1-5 µm anns a bheil αS dùmhail (air a chur ris 1 µM AlexaFluor488-label αS, AF488-αS), faodaidh na feartan electrostatach aca a thighinn bhon strì an aghaidh 10% 1,6-hexanediol (1,6-HD) agus cho cugallach ‘s a tha iad. àrdachadh ann an dùmhlachd NaCl (Fig. 1c).Tha nàdar coltach ri siùbhlach nan coacervates den ionad electrostatach αS/pLK air a dhearbhadh leis a’ chomas aca air leaghadh taobh a-staigh milliseconds (Fig. 1d).A’ cleachdadh turbidimetry, rinn sinn tomhas air cruthachadh boinneagan fo na cumhaichean seo, dhearbh sinn nàdar electrostatach a’ phrìomh eadar-obrachadh co-cheangailte ri seasmhachd (Fig. 1e), agus rinn sinn measadh air a’ bhuaidh a bha aig diofar cho-mheasan polymer air pròiseas LLPS (Fig. 1f).Ged a thathas a’ cumail sùil air cruthachadh droplet thairis air raon farsaing de cho-mheasan polymer, tha am pròiseas gu math fàbharach nuair a tha pLK nas àirde na αS.Thathas cuideachd air sùil a thoirt air LLPn a’ cleachdadh an àidseant tar-chuir dextran-70 (70 kDa) a tha eadar-dhealaichte gu ceimigeach no a’ cleachdadh grunn chruthan sampall, a’ toirt a-steach boinneagan sleamhnachaidh glainne, tobraichean microplate de dhiofar stuthan, Eppendorf no capillaries quartz.
riochdachadh sgeamach de dhiofar roinnean pròtain anns na caochlaidhean WT-αS agus ΔCt-αS a chaidh a chleachdadh san sgrùdadh seo.Tha an raon N-terminal amphipathic, an roinn cruthachadh amyloid hydrophobic (NAC), agus an raon C-terminal le uallach àicheil air an sealltainn ann an gorm, orains, agus dearg, fa leth.Tha am mapa Net Charge Per Residual (NCPR) de WT-αS ri fhaicinn.b Mion-sgrùdadh NMR air an eadar-obrachadh αS / pLK às aonais cnapan macromolecular.Mar a tha dùmhlachd pLK ag àrdachadh (αS: tha co-mheasan molar pLK de 1: 0.5, 1: 1.5, agus 1: 10 air an sealltainn ann an uaine aotrom, uaine, agus dorcha uaine, fa leth).c Coacervate αS/pLK (co-mheas molar 1:10) aig 25 µM (1 µM AF488-label αS no pLK le bileag Atto647N airson ìomhaighean WF) ann am bufair LLPS (mullach) no air a chur ris le 500 mM NaCl (bonn air an taobh chlì) no às deidh % 1,6-hexanediol (1,6-HD; gu h-ìosal air an làimh dheis).Bàr sgèile = 20 µm.d Ìomhaighean microscopach riochdachail de mheasgachadh droplet BF de αS / pLK (co-mheas molar 1: 10) aig dùmhlachd de 25 μM;tha saighdean a’ comharrachadh mar a tha boinneagan fa leth (saighdean dearg is buidhe) a’ tighinn còmhla ann an tuiteam ùr (saighead orains) taobh a-staigh 200 ms).Bàr sgèile = 20 µm.e Sgapadh solais (aig 350 nm) cruinneachadh αS/pLK ann am bufair LLPS ro agus às deidh 500 mM NaCl no 10% 1,6-HD aig 25 µM αS (tha sampall N = 3 ag ath-aithris, mean air mhean agus claonadh àbhaisteach cuideachd air a chomharrachadh).f Ìomhaigh BF (mullach) agus mion-sgrùdadh sgapaidh aotrom (aig 350 nm, bonn) de cho-chruinneachadh αS / pLK aig 25 μM αS le àrdachadh αS: co-mheas molar pLK (ath-aithris sampall N = 3, mean air mhean agus claonadh àbhaisteach cuideachd air a chomharrachadh).Bàr sgèile = 10 µm.Tha am bàr-sgèile air aon ìomhaigh a’ sealltainn sgèile nan ìomhaighean uile ann an aon phannal.Tha dàta amh air a thoirt seachad ann an cruth faidhlichean dàta amh.
Stèidhichte air na beachdan againn air dùmhlachd iom-fhillte electrostatach αS / pLK agus beachdan roimhe air αS mar mholacile teachdaiche den tau / RNA condensate tro eadar-obrachadh dìreach le tau31, smaoinich sinn gum faodadh αS agus tau co-sgaradh leis an fhuasgladh às aonais RNA dùmhlachd.tro iom-fhillteachd electrostatach, agus is e αS am pròtain sgafaid ann an coacervates αS / Tau (faic cuairteachadh cosgais tau ann am Figear 2e).Chunnaic sinn nuair a chaidh 10 μM αS agus 10 μM Tau441 (anns a bheil 1 μM AF488-αS agus 1 μM Atto647N-Tau, fa leth) a mheasgachadh còmhla ann am bufair LLPS, chruthaich iad gu furasta cruinneachaidhean pròtain anns an robh an dà phròtain, mar a chithear le WF microscopy.(Fig. 2a).Chaidh colocalization an dà phròtain anns na boinneagan a dhearbhadh le microscopy confocal (CF) (Fig. 1a a bharrachd).Chaidh giùlan coltach ris a choimhead nuair a chaidh dextran-70 a chleachdadh mar àidseant cruinneachaidh (Fig. 1c Leasachail).A’ cleachdadh an dàrna cuid PEG no dextran le bileag FITC, lorg sinn gu robh an dà riochdaire cruinneachaidh air an sgaoileadh gu cothromach thairis air na sampallan, a’ sealltainn nach robh iad a’ sealltainn sgaradh no ceangal (Fig. 1d a bharrachd).An àite sin, tha e a’ moladh gum bi iad san t-siostam seo a’ brosnachadh dealachadh ìre tro bhuaidhean cruinneachaidh macromolecular, leis gu bheil PEG na àidseant cruinneachaidh seasmhach fàbharach, mar a chithear ann an siostaman LLP eile33,34.Bha na boinneagan làn pròtain sin mothachail air NaCl (1 M) ach chan ann gu 1,6-HD (10% v / v), a’ dearbhadh na feartan electrostatach aca (Fig. 2a, b).Chaidh an giùlan siùbhlach aca a dhearbhadh le bhith a’ cumail sùil air tachartasan droplet aonachadh millisecond a’ cleachdadh microscopy BF (Fig. 2b).
a Confocal (CF) ìomhaighean microscopy de αS / Tau441 coacervates ann am bufair LLPS (10 μM de gach pròtain, 0.5 μM de αS le bileag AF488 agus Tau441 le bileag Atto647N).b Ìomhaighean eadar-aghaidh eadar-theachd eadar-dhealaichte riochdachail (DIC) de thachartasan fusion droplet αS / Tau441 (10 μM airson gach pròtain).c Diagram ìre stèidhichte air sgapadh solais (aig 350 nm) de Tau441 LLPS (0–15 µM) às aonais (clì) no làthaireachd (deas) de 50 µM αS.Tha dathan nas blàithe a’ nochdadh barrachd sgapadh.d Sgapadh aotrom de shamhlaichean αS / Tau441 LLPS le àrdachadh ann an dùmhlachd αS (Tau441 aig 5 µM, N = ath-aithris sampall 2-3 mar a chaidh a chomharrachadh).e Riochdachadh sgeamaigeach de chuid de dh’ atharrachaidhean pròtain tau agus diofar roinnean den phròtain a chaidh a chleachdadh san sgrùdadh seo: fearann ​​​​N-terminal le uallach àicheil (dearg), sgìre làn beairteach (gorm), fearann ​​​​ceangail microtubule (MTBD, air a chomharrachadh ann an orains), agus shnìomhanach paidhir amyloid-forming.roinnean filament (PHF) suidhichte taobh a-staigh an MTBD (liath).Tha mapa cosgais lom gach fuigheall (NCPR) de Tau441 ri fhaicinn.f A’ cleachdadh 1 µM AF488-label αS agus ΔNt- le bileag Atto647N, a’ cleachdadh 1 µM AF488-label αS no ΔCt-αS an làthair ΔNt-Tau (mullach, 10 µM gach pròtain) no pròtain K18 (bonn) ) )) micrographs de WF co-dhlùthaichte ann am bufair LLPS no K18.Tha na bàraichean-sgèile ann an aon ìomhaigh a’ riochdachadh sgèile nan ìomhaighean uile ann an aon phannal (20 µm airson pannalan a, b agus f).Tha dàta amh airson pannalan c agus d air a thoirt seachad mar fhaidhlichean dàta amh.
Gus deuchainn a dhèanamh air àite αS anns a’ phròiseas LLPS seo, rinn sinn sgrùdadh an-toiseach air buaidh αS air seasmhachd droplet le nephelometry a’ cleachdadh barrachd dùmhlachd de NaCl (Fig. 2c).Mar as àirde an dùmhlachd salainn anns na sampallan anns a bheil αS, is ann as àirde na luachan sgapadh solais (aig 350 nm), a tha a’ nochdadh àite seasmhach αS san t-siostam LLPS seo.Faodar an aon bhuaidh fhaicinn le bhith ag àrdachadh dùmhlachd αS (agus mar sin an co-mheas αS: Tau441) gu timcheall air.Àrdachadh 10-fhillte an coimeas ri dùmhlachd tau (5 µM) (Fig. 2d).Gus sealltainn gur e pròtain sgafaid a th’ ann an αS ann an coacervates, chuir sinn romhainn sgrùdadh a dhèanamh air giùlan an mutant Tau a tha air a bhuaireadh le LLPS, aig nach eil sgìre N-terminal le uallach àicheil (fuigheall 1 – 150, faic Fig. 2e) ris an canar ΔNt-Tau.Dhaingnich microscopy WF agus nephelometry nach robh ΔNt-Tau fhèin fo LLPS (Fig. 2f agus Fig. 2d Leasachail), mar a chaidh aithris roimhe 14. Ach, nuair a chaidh αS a chur ri fuasglaidhean sgaoilidh den chaochladh Tau truncated seo, bha am pròiseas LLPS gu tur ath-nuadhachadh le dùmhlachd droplet faisg air dùmhlachd droplet de fhuasglaidhean làn-mheud Tau agus αS fo chumhachan coltach ris agus dùmhlachd pròtain.Faodar am pròiseas seo fhaicinn cuideachd fo chumhachan làn sluaigh macromolecular (Fig. 2c a bharrachd).Chaidh àite na roinne C-terminal αS, ach chan e a fhad gu lèir, ann am pròiseas LLPS a nochdadh le casg air cruthachadh droplet a’ cleachdadh caochladh C-terminal truncated αS às aonais fuigheall 104–140 (Fig. 1a) den (ΔCt-). αS) pròtain (Fig. 2f agus Fig. 2d a bharrachd).Chaidh colocalization αS agus ΔNt-Tau a dhearbhadh le microscopy fluorescence confocal (Fig. 1b a bharrachd).
Gus tuilleadh deuchainn a dhèanamh air an uidheamachd LLPS eadar Tau441 agus αS, chaidh caochladair Tau a bharrachd a chleachdadh, is e sin am pìos cridhe filament helical paidhir (PHF) anns an raon ceangail microtubule (MTBD), ma tha ceithir raointean ath-aithris àbhaisteach ann, ris an canar gu tric. mar chriomag K18 (faic Fig. 2e).Chaidh aithris o chionn ghoirid gu bheil αS nas fheàrr a’ ceangal ri pròtain tau a tha suidhichte ann an raon beairteach proline ann an sreath a tha air thoiseach air an raon ceangail microtubule.Ach, tha an roinn PHF cuideachd beairteach ann am fuigheall le deagh chìsean (faic Figear 2e), gu sònraichte lysine (15% fuigheall), a thug oirnn deuchainn a dhèanamh a bheil an roinn seo cuideachd a’ cur ri dùmhlachd an ionaid αS / Tau.Chunnaic sinn nach b’ urrainn dha K18 leis fhèin LLPS a bhrosnachadh aig dùmhlachdan suas gu 100 μM fo na cumhaichean a chaidh a dhearbhadh (bufair LLPS le 15% PEG no 20% dextran) (Figear 2f).Ach, nuair a chuir sinn 50 µM αS ri 50 µM K18, bha nephelometry (Fig. 2d) agus microscopy WF (Fig. 2f) a’ cruthachadh gu luath de bhroin pròtain anns an robh K18 agus αS.Mar a bhiodh dùil, cha robh e comasach dha ΔCt-αS giùlan LLPS K18 (Fig. 2f) a thoirt air ais.Tha sinn a’ toirt fa-near gu bheil feum aig cruinneachadh αS/K18 air dùmhlachdan pròtain beagan nas àirde gus LLPS a bhrosnachadh an coimeas ri αS/ΔNt-Tau no αS/Tau441, rudan eile a bhith co-ionann.Tha seo co-chòrdail ri eadar-obrachadh nas làidire de roinn αS C-terminal leis an àrainn Tau làn-bheairteach an coimeas ris an àrainn microtubule-ceangail, mar a chaidh a mhìneachadh roimhe 31 .
Leis nach urrainn ΔNt-Tau LLPS a dhèanamh às aonais αS, thagh sinn an caochladh Tau seo mar mhodail airson a bhith a’ comharrachadh αS / Tau LLPS leis cho sìmplidh ‘s a tha e ann an siostaman LLPS le Tau làn-fhaid (isotype, Tau441 / Tau441).le pròiseasan cruinneachaidh iom-fhillte (heterotypic, αS/Tau441).Rinn sinn coimeas eadar an ìre de chruinneachadh αS (mar phàirt den phròtain ìre dùmhail, fαS, c) anns na siostaman αS / Tau agus αS / ΔNt-Tau le centrifugation agus mion-sgrùdadh ìre sgapte SDS-PAGE (faic 2e), lorg luachan glè choltach airson a h-uile pròtain aig an aon dùmhlachd.Gu sònraichte, fhuair sinn fαS, c 84 ± 2% agus 79 ± 7% airson αS / Tau agus αS / ΔNt-Tau, fa leth, a’ moladh gu bheil an eadar-obrachadh heterotypic eadar αS agus tau nas fheàrr na an eadar-obrachadh eadar moileciuilean tau.eadar.
Chaidh an eadar-obrachadh le diofar polycations agus buaidh a’ phròiseas co-dhlùthachaidh air cineataigs αS a sgrùdadh an toiseach leis an ath-bheothachadh fluorescence às deidh modh photobleaching (FRAP).Rinn sinn deuchainn air coacervates αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau agus αS / pLK (100 μM αS le taic bho 2 μM αS AF488-αS agus 100 μM Tau441 no ΔNtM pL no ΔNt-TauK).Chaidh dàta fhaighinn taobh a-staigh a’ chiad 30 mionaid às deidh na pàirtean sampall a mheasgachadh.Bho ìomhaighean riochdachail FRAP (Fig. 3a, dùmhlachd αS/Tau441) agus na cromagan cùrsa ùine co-fhreagarrach aca (Fig. 3b, Fig. 3 Leasachail), chìthear gu bheil cinneasachd αS glè choltach ris an fheadhainn aig coacervates Tau441.agus ΔNt-Tau, a tha fada nas luaithe le pLK.Is e na co-èifeachdan sgaoilidh àireamhaichte airson αS taobh a-staigh an coacervate a rèir FRAP (mar a chaidh a mhìneachadh le Kang et al. 35) D = 0.013 ± 0.009 µm2/s agus D = 0.026 ± 0.008 µm2/s airson α 4/S agus airson α 4/S an αS/ siostam.pLK, Tau, agus D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, fa leth (Fig. 3c).Ach, tha an co-èifeachd sgaoilidh αS anns an ìre sgaoilte grunn òrdughan de mheudachd nas àirde na a h-uile ìre dùmhail, mar a chaidh a dhearbhadh le Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS, faic Fig. 3 Leasachail) fo na h-aon chumhachan (bufair LLPS) ach às aonais polycations. (D = 8 ± 4 µm2/s).Mar sin, tha cinideachd eadar-theangachadh αS air a lughdachadh gu mòr ann an coacervates an coimeas ri pròtanan anns an ìre sgaoilte mar thoradh air buaidhean sluaigh moileciuil follaiseach, ged a chumas a h-uile coacervates togalaichean coltach ri leaghan anns a’ chiad leth uair an dèidh an cruthachadh, an taca ris an ìre tau.cinideachd nas luaithe ann an pLK condensate.
a–c Mion-sgrùdadh FRAP air daineamaigs αS (2% AF488-label αS) ann an coacervates electrostatach.Tha ìomhaighean riochdachail de mheasaidhean αS/Tau441 FRAP ann an trì-fhillte air an sealltainn ann an (a), far a bheil cearcallan dearga a’ comharrachadh raointean le dath.Is e am bàr-sgèile 5 µm.b Curves cuibheasach FRAP agus (c) co-èifeachdan sgaoilidh àireamhaichte (D) airson 5–6 (N) boinneagan eadar-dhealaichte bho thrì deuchainnean a’ cleachdadh 100 µM αS agus co-chruinneachaidhean equimolar de Tau441 (dearg) no ΔNt-Tau (gorm) no pLK (uaine) aig an ìre as àirde de LLPS.Tha an claonadh àbhaisteach den lùb FRAP air a shealltainn ann an dath dubharach.Airson coimeas a dhèanamh, chaidh an co-èifeachd sgaoilidh αS anns an ìre sgaoilte a dhearbhadh ann an trì-fhillte le bhith a’ cleachdadh speactroscopaidh co-dhàimh fluorescence (FCS) (faic Figear Leasachail 3 agus modhan airson tuilleadh fiosrachaidh).d Spectra leantainneach X-band EPR de 100 μM TEMPOL-122-αS ann am bufair LLPS gun polycation (dubh) no an làthair 100 μM Tau441 (dearg) no ΔNt-Tau (gorm) no 1 mM pLK (uaine).Tha an inset a’ sealltainn sealladh meudaichte de na loidhnichean achaidh làidir far a bheil na h-atharrachaidhean as drùidhtiche a’ tachairt.e Cromagan ceangail de 50 μM TEMPOL-122-αS le diofar polycations às aonais LLPS (gun PEG).Thathas a’ sealltainn gu bheil an leudachd lùghdaichte de chòmhlan III an coimeas ri bann II (IIII/III) den speactram àbhaisteach EPR ag àrdachadh co-mheasan molar Tau441 (dearg), ΔNt-Tau (gorm) agus pLK (uaine).Bidh loidhnichean dathte a’ nochdadh iomchaidh airson dàta a’ cleachdadh modal ceangail garbh le n làraich ceangail co-ionann agus neo-eisimeileach air gach lùb.Tha dàta amh air a thoirt seachad ann an cruth faidhlichean dàta amh.
Mar thaic-taic, rinn sinn sgrùdadh air daineamaigs αS ann an grunn coacervates a’ cleachdadh bileagan snìomh stiùirichte (SDSL) agus ath-shuidheachadh paramagnetic dealanach leantainneach (CW-EPR).Tha an dòigh seo air a bhith air leth feumail ann a bhith ag aithris air sùbailteachd agus daineamaigs an IDP le rùn fuigheall reusanta36,37,38.Chun na crìche seo, thog sinn fuigheall cysteine ​​ann an Cys mutants singilte agus chleachd sinn an probe snìomh 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL).Bidh derivatives Maleimide gan comharrachadh.Gu sònraichte, chuir sinn a-steach probes TEMPOL aig suidheachadh 122 no 24 αS (TEMPOL-122-αS agus TEMPOL-24-αS).Anns a 'chiad chùis, bidh sinn ag amas air roinn C-terminal den phròtain, a tha an sàs ann an eadar-obrachadh le polycations.An àite sin, faodaidh suidheachadh 24 fiosrachadh a thoirt dhuinn mu daineamaigs iomlan nam pròtanan anns a’ cho-chòrdadh.Anns gach cùis, bha na comharran EPR a fhuaireadh airson pròtanan den ìre sgaoilte a ’freagairt ri radicals nitroxide anns an t-suidheachadh gluasadach luath.Às deidh sgaradh ìre ann an làthaireachd tau no pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 no ΔNt-Tau aig co-mheas 1: 1 no pLK aig co-mheas 1: 10), chaidh àrdachadh anns an ìre as àirde de dhianas fhaicinn ann an an speactram EPR de αS.Leudaich an loidhne call, a’ nochdadh cinideachd ath-stiùireadh αS lùghdaichte ann am boinneagan an coimeas ri pròtain ann an ìre caol (Fig. 3d, Fig. 4a a bharrachd).Tha na h-atharrachaidhean sin nas fhollaisiche aig suidheachadh 122. Ged aig suidheachadh 24 cha tug làthaireachd pLK buaidh air cineataigs an probe, aig suidheachadh 122 dh’atharraich cumadh na loidhne speactram gu mòr (Fig. 4a Leasachail).Nuair a dh’ fheuch sinn ris an speactram a mhodail aig suidheachadh 122 de dhà shiostam αS/polycation a’ cleachdadh a’ mhodail isotropic (Figear Leasachail 5a) a thathas a’ cleachdadh gu cumanta airson cunntas a thoirt air daineamaigs IDP38,39 le leubail snìomh, cha b’ urrainn dhuinn an speactra deuchainneach ath-thogail..Samhlachadh speactram de shuidheachadh eadar-dhealachaidhean 24 spins (Fig. 5a a bharrachd).Tha seo a’ moladh gu bheil suidheachaidhean fàbharach ann an àite rèiteachaidhean snìomh de roinn C-terminal de αS an làthair polycations.Nuair a thathar a’ beachdachadh air bloigh αS anns an ìre dhlùthaichte fo chumhachan EPR deuchainneach (84 ± 2%, 79 ± 7%, agus 47 ± 4% airson αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau, agus αS / pLK, fa leth - faic an Leasachail). Fig. 2e de mhion-sgrùdadh dàta c), chìthear gu bheil an leudachadh a chaidh a lorg leis an dòigh EPR gu ìre mhòr a’ nochdadh eadar-obrachadh na roinne C-terminal de αS le diofar polycations anns an ìre dhùmhlaichte (am prìomh atharrachadh nuair a thathar a’ cleachdadh TEMPOL-122- αS), agus chan e dùmhlachd pròtain.Thathas a’ faicinn àrdachadh ann am microviscosity anns an probe.Mar a bhiodh dùil, chaidh speactram EPR a 'phròtain fo chumhachan a bharrachd air LLPS ath-nuadhachadh gu tur nuair a chaidh 1 M NaCl a chur ris a' mheasgachadh (Fig. 4b a bharrachd).Gu h-iomlan, tha an dàta againn a’ nochdadh gu bheil na h-atharrachaidhean a lorg CW-EPR gu ìre mhòr a’ nochdadh eadar-obrachadh na roinne C-terminal de αS le diofar polycations anns an ìre dhlùthaichte, agus tha coltas gu bheil an eadar-obrachadh seo nas làidire le pLK na le Tau.
Gus barrachd fiosrachaidh structarail fhaighinn mu na pròtanan anns an coacervate, chuir sinn romhainn sgrùdadh a dhèanamh air an t-siostam LLPS a’ cleachdadh NMR ann am fuasgladh.Ach, cha b’ urrainn dhuinn ach am bloigh αS a bha air fhàgail anns an ìre sgaoilte a lorg, a dh’ fhaodadh a bhith mar thoradh air daineamaigs pròtain nas lugha taobh a-staigh an coacervate agus ìre dùmhail aig bonn an fhuasglaidh ann am mion-sgrùdadh NMR.Nuair a rinn sinn mion-sgrùdadh air structar agus daineamaigs a’ phròtain a bha air fhàgail anns an ìre sgaoilte den sampall LLPS a’ cleachdadh NMR (Fig. 5c, d), mhothaich sinn gun robh am pròtain ga ghiùlan fhèin cha mhòr co-ionann an làthair pLK agus ΔNt-Tau, an dà chuid de a bha ann an structar àrd-sgoile agus dinamics cnàimh-droma pròtain, air fhoillseachadh le deuchainnean air gluasad ceimigeach àrd-sgoile agus fois R1ρ.Tha dàta NMR a’ sealltainn gu bheil an C-terminus de αS a’ fulang call mòr de shùbailteachd co-chòrdaidh fhad ‘s a tha e a’ cumail a nàdar mì-rianail, mar a’ chòrr den t-sreath pròtain, mar thoradh air an eadar-obrachadh le polycations.
Leis gu bheil leudachadh comharra CW-EPR a chaidh fhaicinn anns an ìre dhlùthaichte TEMPOL-122-αS a’ nochdadh eadar-obrachadh a’ phròtain le polycations, rinn sinn titration EPR gus measadh a dhèanamh air dàimh ceangail αS ri diofar polycations às aonais LLPS (gun cruinneachadh de Buffer LLPS), a’ moladh gu bheil na h-eadar-obrachaidhean mar an ceudna ann an ìrean caol agus dlùth (a tha air a dhearbhadh leis an dàta againn, Fig. 4a Leasachail agus Fig. 6 a bharrachd).B’ e an t-amas faicinn a bheil a h-uile coacervates, a dh’ aindeoin na feartan cumanta aca coltach ri lionn, a’ nochdadh giùlan eadar-dhealaichte bunaiteach aig ìre moileciuil.Mar a bhiodh dùil, leudaich an speactram EPR le barrachd dùmhlachd polycation, a’ nochdadh lùghdachadh ann an sùbailteachd moileciuil mar thoradh air eadar-obrachaidhean moileciuil a h-uile com-pàirtiche eadar-obrachaidh cha mhòr gu sùghaidh (Fig. 3e, Fig. 6 a bharrachd).Choilean pLK an sùghaidh seo aig co-mheas molar nas ìsle (polycation: αS) an coimeas ri ΔNt-Tau agus Tau441.Gu dearbh, sheall coimeas eadar an dàta le modal ceangail tuairmseach a’ gabhail ris gu robh làraich ceangail co-ionann agus neo-eisimeileach gu bheil an seasmhach dissociation de pLK (~ 5 μM) na òrdugh meud nas ìsle na òrdugh Tau441 no ΔNt-Tau (~ 50 μM). ).µM).Ged is e tuairmse garbh a tha seo, tha seo a’ nochdadh gu bheil dàimh nas àirde aig αS airson polycations nas sìmplidh le roinnean cosgais adhartach leantainneach.Leis an eadar-dhealachadh seo ann an dàimh eadar αS agus diofar polycations, bha sinn a’ smaoineachadh gum faodadh na feartan leaghaidh aca atharrachadh ann an dòigh eadar-dhealaichte thar ùine agus mar sin fulang le diofar phròiseasan LSPT.
Leis an àrainneachd làn sluaigh taobh a-staigh coacervate pròtain agus nàdar amyloid a’ phròtain, chunnaic sinn giùlan an coacervate thar ùine gus pròiseasan LSPT a lorg.A’ cleachdadh microscopy BF agus CF (Figear 4), thug sinn an aire gu bheil αS / Tau441 a’ co-èigneachadh gu ìre mhòr ann am fuasgladh, a’ cruthachadh boinneagan mòra a bhios a’ conaltradh agus a’ fliuchadh an uachdar aig bonn an tobair/sleamhnag mar làn boinneagan, mar a bhiodh dùil (Fig a bharrachd). .7d);'s e "ràthan pròtain" a chanas sinn ris na structaran bun-stèidh seo.Dh'fhuirich na structaran sin siùbhlach oir ghlèidh iad an comas fuses (Fig. 7b a bharrachd) agus bha iad rim faicinn airson grunn uairean a thìde às deidh LLPS a phiobrachadh (Fig. 4 agus Fig. 7c a bharrachd).Thug sinn an aire gu bheilear a’ còrdadh ris a’ phròiseas fliuchaidh air uachdar stuthan hydrophilic seach stuthan hydrophobic (Fig. 7a Leasachail), mar a bhiodh dùil airson coacervates electrostatach le cosgaisean neo-chothromach agus mar sin comasachd uachdar electrostatach àrd.Gu sònraichte, chaidh co-luachadh agus rafting αS / ΔNt-Tau a lùghdachadh gu mòr, agus chaidh co-chòrdadh αS / pLK a lùghdachadh gu mòr (Fig. 4).Rè na h-ùine goir goirid, bha e comasach dha na boinneagan αS / pLK an uachdar hydrophilic a cho-aonachadh agus a fhliuchadh, ach stad am pròiseas seo gu sgiobalta agus às deidh 5 uairean de goir, cha deach ach tachartasan co-aonaidh cuibhrichte agus cha deach fliuchadh fhaicinn.- gluasad gel-drip.
Riochdaire BF (panalan liath-sgèile) agus CF (panalan deas, αS le bileag AF488 ann an uaine) de shamhlaichean coacervate anns a bheil 100 µM αS (leubail fluorescent 1%) ann am bufair LLPS an làthair 100 µM Tau441 (mullach) ìomhaighean microscopach ΔN -Tau (meadhan) no 1 mM pLK (bonn) aig diofar amannan brosnachaidh agus àirdean fòcas (z, astar bho bhonn a’ phlàta gu math).Chaidh na deuchainnean ath-aithris 4-6 tursan gu neo-eisimeileach bho chèile leis na h-aon toraidhean.Bidh coacervates αS/Tau441 air am fliuchadh às deidh 24 uairean, a’ cruthachadh ràthan nas motha na an ìomhaigh.Is e am bàr-sgèile airson a h-uile dealbh 20 µm.
Dh’ fhaighnich sinn an uairsin an toireadh na amaran pròtain mòra coltach ri lionn a chaidh a chruthachadh ann an αS / Tau441 LLPS gu cruinneachadh amyloid de gin de na pròtanan a chaidh a sgrùdadh.Lean sinn an ìre aibidh de boinneagan αS / Tau441 thar ùine le microscopy WF fo na h-aon chumhachan ris gu h-àrd, ach a’ cleachdadh 1 μM AF488-label αS agus Atto647N-label Tau441 (Fig. 5a).Mar a bhiodh dùil, chunnaic sinn sgìreachadh pròtain iomlan tron ​​​​phròiseas aibidh.Gu inntinneach, bho ca.Às deidh 5 uairean, chunnacas structaran neo-chearcallach nas dian taobh a-staigh nan ràthan, ris an canadh sinn “puingean”, cuid dhiubh air an colocalachadh le αS, agus cuid dhiubh air am beairteachadh ann an Tau441 (Fig. 5a, saighdean geal).Chaidh na spotan sin fhaicinn a-riamh taobh a-staigh ràthan gu ìre nas motha airson αS / ΔNt-Tau na airson αS / ΔNt-Tau.Cha robh spotan sònraichte sam bith anns na boinneagan de shiostaman pLK agus Tau neo-chomasach airson fusion / fliuchadh.Gus dearbhadh a bheil na stains sin anns a bheil αS agus Tau441 nan co-chruinneachaidhean coltach ri amyloid, rinn sinn deuchainn coltach ris a’ cleachdadh miocroscop CF anns an deach Tau441 a chomharrachadh le Atto647N agus chaidh thioflavin-T (ThT) sònraichte amyloid 12.5 μM a chuir ris bhon toiseach.dath.Ged nach deach staining ThT de boinneagan no ràthan αS/Tau441 fhaicinn eadhon às deidh 24 h de dh’ goir (Fig. 5b, sreath àrd - boinneagan a bha air fhàgail thairis air ràthan pròtain), bha structaran ThT-positive anns an robh Atto647N-Tau441 taobh a-staigh nan ràthan gu math lag.tha seo ag ath-aithris meud, cumadh, agus suidheachadh nan spotan a chaidh a mhìneachadh roimhe (Fig. 5b, sreathan meadhan is bonn), a’ moladh gum faodadh na spotan a bhith a rèir co-chruinneachaidhean coltach ri amyloid a chaidh a chruthachadh ann an coacervates lionn a tha a’ fàs nas sine.
WF 25 μM αS aig diofar amannan goir agus àirdean fòcas (z, astar bhon bhonn gun cheangal) an làthair 25 μM Tau441 (1 μM AF488-label αS agus Atto647N-label Tau441) ann an tobar de phlàta miocroscop le bufair LLPS) .Chaidh sia deuchainnean ath-aithris gu neo-eisimeileach le toraidhean co-chosmhail.b Ìomhaigh microscopach CF de 25 μM αS an làthair 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-label Tau441) agus 12.5 μM thioflavin-T (ThT).Tha boinneagan pròtain le cuideam agus ràthan pròtain tasgaidh agus spotan air an sealltainn anns na sreathan gu h-àrd agus sa mheadhan, fa leth.Tha an sreath gu h-ìosal a’ sealltainn ìomhaighean de ràthan agus a’ tuiteam bho 3 mac-samhail neo-eisimeileach.Tha saighdean geal a’ nochdadh dotagan ThT-positive anns an dà phannal.Is e am bàr-sgèile airson a h-uile dealbh 20 µm.
Gus sgrùdadh nas mionaidiche a dhèanamh air na h-atharrachaidhean anns an lìonra pròtain coacervate rè an gluasad bho leaghan gu solid, chleachd sinn ìomhaighean fad-beatha fluorescence (FLIM) agus microscopy gluasad lùth ath-shuidheachadh Förster (FRET) (Figear 6 agus Figearan Leasachail 8 agus 9).Bha sinn a’ smaoineachadh gu bheil coacervate aibidh an t-sreath a-steach do structar pròtain iomlan nas dùmhail no eadhon coltach ri cruaidh a ’leantainn gu ceangal nas dlùithe eadar am pròtain agus an probe flùraiseach a tha ceangailte ris, a dh’ fhaodadh a bhith a ’toirt a-mach buaidh quenching a chithear ann an ùine sgrùdaidh nas giorra (τ) , mar a chaidh a mhìneachadh roimhe40.,41,42.A bharrachd air an sin, airson sampallan le bileagan dùbailte (AF488 agus Atto647N mar dathan tabhartais agus glacadair FRET, fa leth), faodaidh dùmhlachd coacervate agus àrdachadh ann an èifeachdas FRET(E) rè LSPT a bhith an cois an lughdachadh seo ann an τ.Rinn sinn sùil air cruthachadh ràth is spot thar ùine ann an sampaill LLPS αS / Tau441 agus αS / ΔNt-Tau (25 µM de gach pròtain ann am bufair LLPS anns a bheil 1 µM AF488 le bileag αS agus / no Atto647N le bileag Tau441 no ΔNt-Tau).Chunnaic sinn gluasad coitcheann a thaobh gun do lughdaich beatha fluorescence nan probes AF488 (τ488) agus Atto647N (τ647N) beagan mar a bha na coacervates a’ tighinn gu ìre (Fig. 6 agus Fig. 8c a Leasachail).Gu h-inntinneach, chaidh an t-atharrachadh seo àrdachadh gu mòr airson dotagan taobh a-staigh raidh (Fig. 6c), a’ sealltainn gun do thachair barrachd dùmhlachd pròtain aig dotagan.Mar thaic dha seo, cha deach atharrachadh mòr sam bith ann am beatha flùraiseachd fhaicinn airson boinneagan αS / ΔNt-Tau aois airson 24 h (Fig. 8d a bharrachd), a’ moladh gur e pròiseas eadar-dhealaichte bho bhith a’ faicinn agus nach eil ath-eagrachadh mòr moileciuil a th’ ann an gelation droplet. taobh a-staigh coacervates.Bu chòir a thoirt fa-near gu bheil diofar mheudan agus susbaint caochlaideach aig na dotagan ann an αS, gu sònraichte airson an t-siostam αS/Tau441 (Fig. 8e a bharrachd).An cois an lùghdachadh ann am beatha fluorescence spot bha àrdachadh ann an dian, gu sònraichte airson Atto647N le bileag Tau441 (Fig. 8a Leasachail), agus èifeachdas FRET nas àirde airson an dà chuid αS / Tau441 agus αS / ΔNt-Tau siostaman, a’ nochdadh barrachd dùmhlachd ann an LLPS Còig uairean às deidh a bhith air a phiobrachadh, tha na pròtanan taobh a-staigh an dealan statach dlùth.An coimeas ri αS / ΔNt-Tau, chunnaic sinn luachan τ647N nas ìsle agus beagan nas àirde τ488 ann an spotan αS / Tau441, còmhla ri luachan FRET nas ìsle agus nas neo-àbhaisteach.Dh’ fhaodadh seo a bhith co-cheangailte ris an fhìrinn, anns an t-siostam αS / Tau441, gu bheil am pailteas αS a chaidh fhaicinn agus ris a bheil dùil ann an cruinneachaidhean nas ioma-ghnèitheach, gu tric substoichiometric an taca ri Tau, leis gum faodadh Tau441 fhèin a dhol tro LLPS agus cruinneachadh (Fig. 8e a bharrachd) .Ach, tha an ìre de cho-fhilleadh droplet, cruthachadh ràth, agus, gu cudromach, cruinneachadh pròtain taobh a-staigh coacervates coltach ri leaghan aig a’ char as àirde nuair a tha an dà chuid Tau441 agus αS an làthair.
a Microscopy fluorescence fad-beatha (FLIM) ìomhaighean de αS / Tau441 agus αS / ΔNt-Tau aig 25 μM de gach pròtain (1 μM AF488-label αS agus 1 μM Atto647N-label Tau441 no ΔNT-buffer.Tha na colbhan a’ sealltainn ìomhaighean riochdachail de shamhlaichean LLPS aig diofar amannan aibidh (30 min, 5 h agus 24 h).Tha am frèam dearg a’ sealltainn na sgìre anns a bheil spotan αS/Tau441.Tha raointean beatha air an sealltainn mar bhàraichean dath.Bàr-sgèile = 20 µm airson a h-uile dealbh.b Ìomhaigh FLIM air a shìneadh a-steach den raon taghte, ri fhaicinn sa bhogsa dearg ann am pannal a.Tha raointean beatha air an sealltainn a’ cleachdadh an aon sgèile dath agus a tha ann am pannal a.Bàr sgèile = 5 µm.c Histograman a’ sealltainn AF488 (ceangailte ri αS) no Atto647N (ceangailte ri Tau) airson diofar ghnèithean pròtain (droplets-D-, raft-R- agus speckle-P) air an comharrachadh ann an ìomhaighean FLIM a chaidh a chlàradh airson αS-) sgaoilidhean tìm fad beatha Tau441 agus Sampaill coacervate αS / ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI airson D, 29-44 ROI airson R, agus 21-51 ROI airson puingean).Tha luachan meadhanach agus meadhanach air an sealltainn mar cheàrnagan buidhe agus loidhnichean dubha am broinn bogsaichean, fa leth.Tha crìochan ìosal is àrd a’ bhogsa a’ riochdachadh a’ chiad agus an treas cairteal, fa leth, agus tha na luachan as ìsle agus as àirde taobh a-staigh an raon eadar-chairteal 1.5-fhillte (IQR) air an sealltainn mar whiskers.Tha outliers air an sealltainn mar daoimeanan dubha.Chaidh brìgh staitistigeil eadar paidhrichean sgaoilidhean a dhearbhadh le bhith a’ cleachdadh deuchainn-t dà-shampall, a’ gabhail ris gu bheil eadar-dhealachaidhean neo-ionann.Tha luachan p deuchainn-t dà-earball air an sealltainn le rionnagan airson gach paidhir de dhàta coimeasach (* p-value> 0.01, ** p-value> 0.001, *** p-value> 0.0001, **** p-value> 0.00001), ns A’ nochdadh dearmad (luach-p> 0.05).Tha na dearbh luachan p air an toirt seachad ann an Clàr Leasachail 1, agus tha an dàta tùsail air a thaisbeanadh mar fhaidhlichean dàta amh.
Gus tuilleadh taisbeanaidh a dhèanamh air nàdar amyloid coltach ri speckles / co-chruinneachaidhean, dhèilig sinn ri sampallan coacervate neo-mhìnichte airson 24 uair le dùmhlachdan àrda de (1 M) NaCl, a lean gu sgaradh cruinneachaidhean bho coacervates pròtain.Nuair a chaidh co-chruinneachaidhean iomallach (ie, fuasgladh sgaoilte de cho-chruinneachaidhean) fhaicinn a’ cleachdadh microscopy feachd atamach (AFM), chunnaic sinn morf-eòlas spherical sa mhòr-chuid le àirde cunbhalach de mu 15 nm, a tha buailteach a bhith ceangailte fo chumhachan dùmhlachd àrd salainn, coltach ri giùlan fibrilean amyloid àbhaisteach mar thoradh air a’ bhuaidh làidir hydrophobic air an uachdar (thoir an aire gu bheil àirde de ~10 nm aig fibrils mar as trice) (Fig. 10a a bharrachd).Gu h-inntinneach, nuair a chaidh cruinneachaidhean iomallach a bhrosnachadh le ThT ann am measadh fluorescence ThT àbhaisteach, chunnaic sinn àrdachadh mòr ann an toradh cuantamach fluorescence ThT, an coimeas ris an fhear a chaidh fhaicinn nuair a chaidh an dath a bhrosnachadh le fibrilean amyloid αS àbhaisteach (Fig. 10b a bharrachd), a’ moladh sin tha structaran coltach ri amyloid anns na coacervate..Gu dearbh, bha na cruinneachaidhean a’ fulang le dùmhlachdan salainn àrd ach mothachail air 4 M guanidine chloride (GdnHCl), mar fibrilean amyloid àbhaisteach (Fig. 10c a bharrachd).
An uairsin, rinn sinn mion-sgrùdadh air co-dhèanamh nan cruinneachaidhean a’ cleachdadh fluorescence moileciuil singilte, co-dhàimh fluorescence sònraichte / speactroscopaidh tar-cho-cheangail (FCS / FCCS), agus mion-sgrùdadh spreadhaidh air lorg co-thuiteamas dà-dath (TCCD).Chun na crìche seo, dh’ fhàg sinn cruinneachaidhean iomallach a chaidh a chruthachadh às deidh 24 uairean de ghoir ann an sampaill 100 μl LLPS anns a bheil αS agus Tau441 (an dà chuid 25 μM) còmhla ri 1 μM AF488-label αS agus 1 μM Atto647N-label Tau441.Lùghdaich am fuasgladh iomlan sgaoilte a thig às gu staid monomolecular a’ cleachdadh an aon bufair gun PEG agus 1 M NaCl (an aon bufair a thathas a’ cleachdadh gus cruinneachaidhean a sgaradh bho coacervate) gus casg a chuir air eadar-obrachadh electrostatach sam bith eadar LLPS agus pròtain.Tha eisimpleir de shlighe ùine aon mholacile ri fhaicinn ann am Fig. 7a.Sheall mion-sgrùdadh FCCS / FCS (tar-cho-cheangal, CC agus fèin-cho-cheangal, AC) gu robh co-chruinneachaidhean anns an robh αS agus tau pailt anns na sampallan (faic lùb CC ann am Fig. 7b, pannal clì), agus dh’ èirich cus de phròtain monomeric fuigheall mar a toradh a’ phròiseas caolachaidh (faic lùban AC ann am Figear 7b, am pannal clì).Cha do sheall deuchainnean smachd a chaidh a dhèanamh fo na h-aon chumhachan fuasglaidh a’ cleachdadh sampaill anns an robh pròtainean monomeric a-mhàin lùban CC, agus tha na lùban AC a’ freagairt gu math ris a’ mhodal sgaoilidh aon-phàirt (Eq. 4), far a bheil na co-èifeachdan sgaoilidh ris a bheil dùil aig pròtanan monomeric (Fig. 7b. ), pannal deas).Tha an co-èifeachd sgaoilidh de ghràineanan cruinn nas lugha na 1 µm2/s, agus tha co-èifeachd pròtainean monomeric timcheall air 1 µm2/s.50-100 µm/s;tha luachan coltach ri luachan a chaidh fhoillseachadh roimhe airson fibrils amyloid sonicated αS agus monomeric αS air leth fo chumhachan fuasglaidh coltach44.Nuair a rinn sinn mion-sgrùdadh air na cruinneachaidhean le mion-sgrùdadh spreadhaidh TCCD (Fig. 7c, panail gu h-àrd), lorg sinn anns gach cruinneachadh iomallach (αS/Tau heteroaggregate), gu robh timcheall air 60% de na cruinneachaidhean a chaidh a lorg a’ toirt a-steach an dà chuid αS agus tau, bha timcheall air 30% a-mhàin Tau, mu 10% αS a-mhàin.Sheall mion-sgrùdadh stoichiometric de heteroaggregates αS / Tau gu robh a’ mhòr-chuid de na heteroaggregates air an saidhbhreachadh ann an tau (stoichiometry fo 0.5, tha an àireamh chuibheasach de mholacilean tau gach iomlanachd 4 tursan nas motha na moileciuilean αS), a tha co-chòrdail ris an obair againn a chaidh fhaicinn ann an FLIM in situ. deuchainnean..Sheall mion-sgrùdadh FRET gu robh an dà phròtain anns na co-chruinneachaidhean sin, ged nach eil na fìor luachan FRET sa chùis seo air leth cudromach, leis gu robh cuairteachadh fluorophores anns gach cruinneachadh air thuaiream mar thoradh air cus de phròtain gun ainm a chaidh a chleachdadh san deuchainn.Gu h-inntinneach, nuair a rinn sinn an aon sgrùdadh a’ cleachdadh an caochladair Tau a bha easbhaidheach ann an cruinneachadh amyloid aibidh 45,46 (faic Fig. Leasachail 11a,b), mhothaich sinn ged a bha an cruinneachadh electrostatach αS mar an ceudna (Fig. 11c a bharrachd, d), chaidh an comas air cruinneachaidhean a chruthachadh taobh a-staigh an coacervate a lughdachadh gu mòr agus lorg FLIM grunn spotan ann an deuchainnean in situ, agus chaidh lùban tar-cheangail lag fhaicinn airson sampallan iomlan iomallach.Ach, airson àireamh bheag de cho-chruinneachaidhean a chaidh a lorg (dìreach an deicheamh cuid de Tau441), chunnaic sinn gun robh gach cruinneachadh air a bheairteachadh ann an αS na an caochladh Tau seo, le timcheall air 50% de na co-chruinneachaidhean a chaidh a lorg anns nach robh ach moileciuilean αS, agus bha αS ioma-ghnèitheach ann an còrr. .co-chruinneachaidhean (faic Fig. 11e Leasachail), an taca ris na co-chruinneachaidhean ioma-ghnèitheach a chruthaich Tau441 (Fig. 6f).Sheall toraidhean nan deuchainnean sin ged a tha αS fhèin comasach air cruinneachadh le tau taobh a-staigh an coacervate, tha tau nucleation nas fàbharach fo na cumhaichean sin, agus gu bheil na co-chruinneachaidhean coltach ri amyloid comasach air a bhith nan cruth de αS agus tau.Ach, aon uair ‘s gu bheil cridhe làn tau air a chruthachadh, thathas a’ còrdadh ri eadar-obrachadh heterotypic eadar αS agus tau ann an co-chruinneachaidhean thairis air eadar-obrachadh homotypic eadar moileciuilean tau;bidh sinn cuideachd a’ cumail sùil air lìonraidhean pròtain ann an leaghan αS/tau coacervates.
lorgan fluorescence riochdachail de mholacilean singilte de cho-chruinneachaidhean iomallach air an cruthachadh ann an coacervates electrostatach αS / Tau441.Chaidh spreadhaidhean co-ionann ri co-chruinneachaidhean αS / Tau441 (spreadhaidhean os cionn na stairsnich ainmichte) fhaicinn ann an trì seanalan lorg (sgaoilidh AF488 agus Atto647N às deidh excitation dìreach, loidhnichean gorm is dearg, sgaoilidhean Atto647N às deidh excitation neo-dhìreach), FRET, loidhne violet).b Mion-sgrùdadh FCS / FCCS air sampall de cho-chruinneachaidhean iomallach αS / Tau441 a fhuaireadh bho LLPS (pannal clì).Tha lùban fèin-cho-dhàimh (AC) airson AF488 agus Atto647N air an sealltainn ann an gorm is dearg, fa leth, agus tha cromagan crois-cheangail (CC) co-cheangailte ri co-chruinneachaidhean anns a bheil an dà dhath air an sealltainn ann am purpaidh.Tha na lùban AC a’ nochdadh làthaireachd gnèithean pròtain monomeric agus cruinnichte, fhad ‘s a tha na lùban CC a’ sealltainn dìreach an sgaoileadh de cho-chruinneachaidhean le dà bhileag.An aon sgrùdadh, ach fo na h-aon chumhachan fuasglaidh agus ann an àiteachan iomallach, tha sampaill anns nach eil ach αS monomeric agus Tau441 air an sealltainn mar smachdan anns a ’phannal cheart.c Mion-sgrùdadh flash fluorescence de mholacilean singilte de cho-chruinneachaidhean iomallach air an cruthachadh ann an coacervates electrostatach αS / Tau441.Tha fiosrachadh airson gach iomlan a chaidh a lorg ann an ceithir ath-chuairtean eadar-dhealaichte (N = 152) air a dhealbhadh a rèir an stoichiometry, luachan S, agus èifeachdas FRET (pannal gu h-àrd, bàr dath a’ nochdadh tachartas).Faodar trì seòrsaichean de cho-chruinneachaidhean a chomharrachadh: -αS-a-mhàin co-chruinneachaidhean le S~1 agus FRET~0, Tau-a-mhàin co-chruinneachaidhean le S~0 agus FRET~1, agus co-chruinneachaidhean Tau/αS heterogeneous le eadar-mheadhanach S agus FRET Measaidhean den t-suim den dà phròtain comharrachaidh a chaidh a lorg anns gach cruinneachadh heterogeneous (N = 100) air an sealltainn anns a’ phannal ìosal (tha an sgèile dath a’ nochdadh na thachair).Tha dàta amh air a thoirt seachad ann an cruth faidhlichean dàta amh.
Thathas air aithris gu bheil aibidh no aosda pròtain liùlach a’ co-fhilleadh a-steach do structaran coltach ri gel no cruaidh thar ùine an sàs ann an grunn ghnìomhan fios-eòlasach den cho-chòrdadh47 a bharrachd air galair, mar phròiseas neo-àbhaisteach ro chruinneachadh amyloid 7, 48, 49. An seo bidh sinn a’ sgrùdadh dealachadh ìre agus giùlan gu mionaideach.LSPT αS an làthair polycations air thuaiream ann an àrainneachd fo smachd aig co-chruinneachaidhean ìosal micromolar agus suidheachaidhean a tha iomchaidh a thaobh eòlas-eòlas (thoir an aire gur e an dùmhlachd fios-eòlasach àireamhaichte de αS> 1 µM50), às deidh giùlan àbhaisteach LPS air a stiùireadh le thermodynamic.Fhuair sinn a-mach gu bheil αS, anns a bheil roinn C-terminal le droch chosgais aig pH fios-eòlasach, comasach air boinneagan làn pròtain a chruthachadh ann am fuasgladh uisgeach tro LLPS an làthair peptides le mì-rian mòr cationic leithid pLK no Tau tro phròiseas electrostatach. dùmhlachd iom-fhillte ann an làthaireachd macromolecules cruinneachaidh.Dh’ fhaodadh gum bi buaidhean buntainneach aig a’ phròiseas seo anns an àrainneachd cheallach far am bi αS a’ tighinn tarsainn air grunn mholacilean polycationic co-cheangailte ris an cruinneachadh co-cheangailte ri galair an dà chuid in vitro agus in vivo51,52,53,54.
Ann an iomadh sgrùdadh, thathas air beachdachadh air daineamaigs pròtain taobh a-staigh boinneagan mar aon de na prìomh nithean a tha a’ dearbhadh pròiseas aibidh55,56.Ann an electrostatic αS coacervates le polycations, tha e coltach gu bheil am pròiseas aibidh an urra ri neart eadar-obrachadh le polycations, valence, agus iomadachd nan eadar-obrachaidhean sin.Tha teòiridh co-ionannachd a’ moladh gur e cruth-tìre co-chothromachd de dhà stàit leaghaidh a bhiodh ann an làthair droplet mòr làn de biopolymers a bhios a’ draibheadh ​​LLPS57,58.Faodar fàs droplet a choileanadh le Ostwald maturation59, coalescence60 no caitheamh monomer an-asgaidh anns an ìre sgapte61.Airson αS agus Tau441, ΔNt-Tau no pLK, bha a ’mhòr-chuid den phròtain air a chuimseachadh anns a’ cho-chòrdadh fo na cumhaichean a chaidh a chleachdadh san sgrùdadh seo.Ach, ged a bha boinneagan tau làn-mheud a’ tighinn còmhla gu sgiobalta air fliuchadh uachdar, bha co-fhilleadh droplet agus fliuchadh duilich dha ΔNt-Tau agus pLK, a’ moladh call luath de thogalaichean leaghaidh anns an dà shiostam sin.A rèir ar mion-sgrùdadh FLIM-FRET, sheall na boinneagan aois pLK agus ΔNt-Tau an aon ìre de chruinneachadh pròtain (beatha fluorescence coltach ris) ris na boinneagan tùsail, a’ moladh gun deach an lìonra pròtain tùsail a chumail, ged a bha e nas cruaidhe.
Bidh sinn a’ reusanachadh ar toraidhean deuchainneach anns a’ mhodail a leanas (Figear 8).Is e lìonraidhean pròtain a th’ anns na boinneagan a chaidh a chruthachadh an toiseach airson ùine gun airgead dìolaidh electrostatach, agus mar sin tha raointean de mhì-chothromachadh cosgais ann, gu sònraichte aig an eadar-aghaidh droplet, a’ leantainn gu boinneagan le comas uachdar electrostatach àrd.Gus dìoladh a dhèanamh airson cosgais (iongantas ris an canar gu tric ìsleachadh valence) agus lughdachadh comas uachdar nam boinneagan, faodaidh na boinneagan polypeptides ùra a thoirt a-steach bhon ìre lag, ath-eagrachadh lìonraidhean pròtain gus eadar-obrachadh cosgais a mheudachadh, agus eadar-obrachadh le boinneagan eile.le uachdar (wetting).Tha e coltach gu bheil na boinneagan αS / pLK, mar thoradh air an lìonra pròtain nas sìmplidh aca (dìreach eadar-obrachaidhean heterotypic eadar αS agus pLK) agus barrachd dàimh airson eadar-obrachaidhean pròtain-phròtain, comasach air cosgais a’ cho-dhlùthachaidh a chothromachadh nas luaithe;gu dearbh, chunnaic sinn cinnteachd pròtain nas luaithe ann an coacervates αS / pLK a chaidh a chruthachadh an toiseach na ann an αS / Tau.Às deidh ìsleachadh valence, bidh na h-eadar-obrachaidhean a’ fàs nas giorra agus bidh na boinneagan a’ call am feartan leaghaidh agus a’ tionndadh gu boinneagan neo-lasanta coltach ri gel le comas uachdar electrostatach ìosal (agus mar sin gun chomas an uachdar fhliuchadh).An coimeas ri sin, chan eil boinneagan αS / Tau cho èifeachdach ann a bhith ag àrdachadh cothromachadh cosgais droplet mar thoradh air lìonraidhean pròtain nas iom-fhillte (le eadar-obrachaidhean homotypic agus heterotypic) agus nàdar nas laige eadar-obrachaidhean pròtain.Bidh seo a’ leantainn gu boinneagan a chumas giùlan leaghaidh airson amannan fada agus a tha a’ nochdadh comas uachdar electrostatach àrd a tha buailteach a bhith air a lughdachadh le bhith a’ tighinn còmhla agus a’ fàs (mar sin a’ lughdachadh farsaingeachd uachdar/co-mheas meud nam boinneagan) agus le bhith a’ fliuchadh a’ cheim uachdar hydrophilic.Bidh seo a’ cruthachadh leabharlannan pròtain mòr dùmhail a chumas feartan siùbhlach leis gu bheil na h-eadar-obrachaidhean fhathast gu math neo-ghluasadach mar thoradh air a bhith a’ coimhead gu cunbhalach airson optimization cosgais anns an lìonra pròtain.Gu h-inntinneach, tha cruthan Tau a tha air an giorrachadh le N, a’ toirt a-steach cuid de isoforms62 a tha a’ nochdadh gu nàdarra, a’ nochdadh giùlan eadar-mheadhanach, le cuid a’ coacervates a’ fàs nas sine le αS gu boinneagan fad-ùine coltach ri gel, agus cuid eile a’ tionndadh gu bhith nan co-dhlùthan mòra leaghaidh.Tha an dùbailteachd seo ann an aibidh coacervates electrostatach αS co-chòrdail ri sgrùdaidhean teòiridheach agus deuchainneach LLPS o chionn ghoirid a tha air co-dhàimh a chomharrachadh eadar ìsleachadh valence agus criathradh electrostatach ann an condensates mar phrìomh dhòigh air smachd a chumail air meud co-dhlùthachaidh agus feartan siùbhlach.Uidheam 58.61.
Tha an sgeama seo a’ sealltainn an t-slighe cruinneachaidh amyloid putative airson αS agus Tau441 tro LLPS agus LSPT.Le roinnean a bharrachd beairteach anion (dearg) agus cation-beairteach (gorm), tha lùth uachdar nas ìsle aig αS agus tau electrostatic coacervates le valence riarachail agus mar sin nas lugha de cho-aontachd, a’ leantainn gu aois droplet luath.Tha staid gel seasmhach neo-chruinnichte air a choileanadh..Tha an suidheachadh seo gu math fàbharach a thaobh an t-siostam αS / pLK air sgàth an dàimh nas àirde agus an lìonra eadar-obrachaidh paidhir pròtain nas sìmplidh, a leigeas le gluasad luath coltach ri gel.Air an làimh eile, bidh boinneagan le valence neo-thaitneach agus, mar sin, roinnean le uallach pròtain a tha rim faighinn airson eadar-obrachadh, ga dhèanamh nas fhasa don choacervate an uachdar hydrophilic a leaghadh agus a fhliuchadh gus an lùth uachdar àrd aige a lughdachadh.Tha an suidheachadh seo nas fheàrr airson coacervates αS / Tau441, aig a bheil lìonra iom-fhillte ioma-fhillte anns a bheil eadar-obrachaidhean lag Tau-Tau agus αS-Tau.An uair sin, cumaidh coacervates nas motha na feartan coltach ri lionn aca, a’ leigeil le eadar-obrachaidhean pròtain-gu-phròtain eile tachairt.Mu dheireadh, bidh co-chruinneachaidhean amyloid heterogeneous anns a bheil an dà chuid αS agus tau ann an cruth lionn coacervate, a dh’ fhaodadh a bhith co-cheangailte ris an fheadhainn a lorgar ann am buidhnean in-ghabhail, a tha nan comharran de ghalaran neurodegenerative.
Tha na structaran mòra coltach ri sileadh a chaidh a chruthachadh aig àm aibidh αS / Tau441 le àrainneachd pròtain làn dùmhail ach fiùghantach agus, gu ìre nas lugha, αS / ΔNt-Tau coacervates nan stòran-tasgaidh air leth freagarrach airson cruinneachadh pròtain a dhùsgadh.Tha sinn gu dearbh air faicinn cruthachadh co-chruinneachaidhean pròtain cruaidh anns an t-seòrsa coacervates pròtain seo, gu tric anns a bheil an dà chuid αS agus tau.Tha sinn air sealltainn gu bheil na heteroaggregates sin air an socrachadh le eadar-obrachaidhean neo-dealanach, comasach air dathan ThT sònraichte amyloid a cheangal san aon dòigh ri fibrilean amyloid àbhaisteach, agus gu dearbh tha iad an aghaidh diofar bhuaidhean.Chaidh sealltainn gu robh feartan coltach ri amyloid aig na cruinneachaidhean αS/tau a chruthaich LLPS.Gu dearbh, tha an caochladh aibidh de Tau a tha easbhaidheach ann an cruinneachadh amyloid air a mhilleadh gu mòr ann an cruthachadh nan cruinneachaidhean αS heterogeneous sin taobh a-staigh an coacervate electrostatach leaghaidh.Chaidh cruthachadh cruinneachaidhean αS / Tau441 fhaicinn a-mhàin taobh a-staigh nan coacervates, a ghlèidh togalaichean coltach ri leaghan, agus a-riamh, mura ruigeadh na coacervates / boinneagan an staid gel.Anns a ’chùis mu dheireadh, tha barrachd neart eadar-obrachaidhean electrostatach agus, mar thoradh air an sin, cruas an lìonra pròtain a’ cur casg air ath-rèiteachadh co-chòrdalachd riatanach de phròtainean gus eadar-obrachaidhean pròtain ùra a stèidheachadh a tha riatanach airson nucleation amyloid.Ach, faodar seo a choileanadh ann an coacervates nas sùbailte, coltach ri leaghan, a tha e fhèin nas dualtaiche fuireach leaghaidh mar a bhios iad ag àrdachadh ann am meud.
Tha an fhìrinn gu bheil cruthachadh cruinneachaidhean taobh a-staigh na h-ìre dùmhail nas fheàrr ann an αS / Tau condensates mòra na ann am boinneagan beaga a bhios a’ glaodhadh gu sgiobalta, a’ nochdadh cho iomchaidh ‘s a tha e a bhith a’ comharrachadh nam feartan a tha a’ cumail smachd air co-chòrdadh droplet.Mar sin, chan e a-mhàin gu bheil claonadh ann airson sgaradh ìre, ach feumar smachd a chumail air meud a’ cho-dhlùthachaidh airson obrachadh ceart a bharrachd air casg ghalaran58,61.Tha na toraidhean againn cuideachd a’ soilleireachadh cho cudromach sa tha an cothromachadh eadar LLPS agus LSPT airson siostam αS/Tau.Ged a dh’ fhaodadh cruthachadh droplet dìon an aghaidh cruinneachadh amyloid le bhith a’ lughdachadh na tha de mhonaimirean pròtain a tha rim faighinn fo chumhachan sùghaidh, mar a chaidh a mholadh ann an siostaman eile63,64, dh’ fhaodadh fusion droplet aig ìrean droplet àrd leantainn gu cruinneachadh pròtain a-staigh tro ath-rèiteachaidhean slaodach slaodach.lìonraidhean pròtain..
Gu h-iomlan, tha an dàta againn a’ cur cuideam làidir air iomchaidheachd valence co-leanailteach agus eadar-obrachaidhean riaraichte/mì-riaraichte ann an lìonraidhean drop ann an co-theacsa LSPT.Gu sònraichte, tha sinn a’ sealltainn gu bheil condensates làn-fhad αS/Tau441 comasach air leaghadh agus nucleate gu h-èifeachdach gus heteroaggregates coltach ri amyloid a chruthachadh a tha a’ toirt a-steach an dà chuid pròtanan agus a’ moladh uidheamachd moileciuil stèidhichte air na toraidhean deuchainneach againn.Is dòcha gu bheil co-chruinneachadh dà phròtain ann an coacervate fluid αS / Tau a tha sinn ag aithris an seo co-cheangailte ri co-shuidheachadh dà phròtain ann an in-ghabhail, a tha nan comharran den ghalar, agus dh’ fhaodadh iad cur ri bhith a’ tuigsinn a’ cheangail eadar LLPS agus cruinneachadh amyloid, a’ fuasgladh na slighe airson IDP le uallach mòr ann an neurodegeneration.
Monomeric WT-αS, cysteine ​​mutants (Q24C-αS, N122C-αS) agus ΔCt-αS caochlaidhean (Δ101-140) air an cur an cèill ann an E. coli agus air an glanadh mar a chaidh a mhìneachadh roimhe.Chaidh 5 mM DTT a ghabhail a-steach anns a h-uile ceum ann a bhith a’ glanadh αS cysteine ​​mutants gus casg a chuir air cruthachadh bannan disulfide.Tau441 isoform (plasmid air fhaighinn bho Addgene #16316), caochladair ΔNt-Tau (Δ1–150, air fhaighinn le bhith a’ clonadh IVA le primers CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTCTTTAAAGTTAAAC) agus AggDef-Tau 1 purified) agus AggDef-150, prìomhadaiche 1-150, 130, 2018. bha cultaran coli fàs gu OD600 = 0.6 – 0.7 aig 37 ° C agus 180 rpm, agus chaidh faireachdainn a bhrosnachadh le IPTG airson 3 uairean aig 37 ° C.Buain ceallan aig 11,500 xg airson 15 min aig 4 ° C agus nigh le bufair saline anns a bheil 150 mM NaCl.Ath-chuiridh am peilear ann am bufair lysis (20 ml gach 1 L LB: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM, copeptin 1).Chaidh an ceum sonication a dhèanamh air deigh le amplitude de 80% airson buillean 10 (1 min air adhart, 1 min dheth).Na bi nas àirde na 60 ml ann an aon ultrasound.Bha E. coli lysates air an teasachadh aig 95 ° C. airson 20 mionaid, an uairsin air fhuarachadh air deigh agus air an centrifuged aig 127,000 × g airson 40 mionaidean.Chaidh an supernatant soilleir a chuir an sàs ann an membran 3.5 kDa (Spectrum ™ Thermo Fisher Scientific, RA) agus dialyzed an aghaidh 4 L de bufair dialysis (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM , PMSF 0.1 mM) airson 10 uairean.Chaidh colbh iomlaid cation 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) a chothromachadh le bufair cothromachaidh (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Chaidh an tau lysate a shìoladh tro chriathrag 0.22 μm PVDF agus a chuir a-steach don cholbh aig ìre sruth de 1 ml / min.Chaidh Elution a dhèanamh mean air mhean, chaidh tau a chuir a-mach le bufair elution 15-30% (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Chaidh bloighean a sgrùdadh le SDS-PAGE, agus chaidh bloighean sam bith anns an robh aon chòmhlan leis a’ chuideam moileciuil ris an robh dùil tau a chuimseachadh le bhith a’ cleachdadh sìoltachan centrifuge 10 kDa agus chaidh bufair a chuir na àite anns an robh 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM agus DTT 2 mM airson B' e 100 μM an ìre mu dheireadh de phròtain.Chaidh am fuasgladh pròtain an uairsin a chuir tro chriathrag 0.22 μm PVDF, reòta gu sgiobalta agus stòradh aig -80 ° C.Chaidh Protein K18 a thoirt seachad gu coibhneil leis an Ollamh Alberto Boffi.B’ e purrachd an ullachaidh> 95% mar a chaidh a dhearbhadh le SDS-PAGE agus MALDI-TOF/TOF.Chaidh diofar cysteines a chomharrachadh gu ceimigeach le AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) no TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada).air an dearbhadh le sùghadh agus MALDI-TOF/TOF.Chaidh Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau agus K18 a chomharrachadh le fuigheall cysteine ​​​​dùthchasach aig dreuchdan 191 agus 322 a ’cleachdadh Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, a’ Ghearmailt) a ’leantainn an aon mhodh-obrach.Chaidh cosgais lom gach mapaichean fuigheall airson αS agus Tau441 a chruthachadh a’ cleachdadh CIDER66.
Chaidh poly-L-lysine soladach (pLK DP 90-110 a rèir NMR bhon t-solaraiche, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) a sgaoileadh ann an 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 gu 10 mM dùmhlachd, pròiseas sonicated airson 5 mionaidean ann an amar uisge ultrasonic agus stòradh aig -20 ° C.Tha PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) agus FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) so-sgaoilte uisge agus air an sgaoileadh gu farsaing ann am bufair LLPS.Bidh dialysis a 'toirt air falbh salainn truaillidh.Bha iad an uairsin air an sìoladh tro chriathrag steallaire le meud pore de 0.22 μm, agus chaidh na dùmhlachdan aca a thomhas a’ cleachdadh refractometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).Chaidh sampallan LLPS ullachadh aig teòthachd an t-seòmair san òrdugh a leanas: chaidh bufair agus eas-tharraing a mheasgachadh agus 1 mM tris (2-carboxyethyl) fosphine (TCEP, Carbosynth, Compton, RA), 1 mM 2,2,2,2- (Ethane-). 1, 2-diyldinitrile) tetraacetic acid (EDTA, carboxynth) agus measgachadh de 1% protease inhibitor (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM).An uairsin thèid αS agus polycations ceangailte (roghainnean pLK no Tau) a chur ris.Airson deuchainnean sreath ùine thioflavin-T (ThT, Carbosynth, Compton, RA), cleachd an dùmhlachd ThT iomlan gu bhith na leth den cho-chruinneachadh αS.Measgaich na sampallan gu socair ach gu mionaideach gus dèanamh cinnteach gu bheil iad aon-ghnèitheach.Bha dùmhlachd gach co-phàirt ag atharrachadh bho dheuchainn gu deuchainn, mar a chaidh a mhìneachadh ann an earrann nan Toraidhean.Chaidh Azide a chleachdadh aig dùmhlachd de 0.02% (w / v) nuair a bha fad an deuchainn nas fhaide na 4 uairean.Airson a h-uile mion-sgrùdadh a’ cleachdadh sampallan LLPS, leig leis a’ mheasgachadh cothromachadh a dhèanamh airson 5 mionaidean mus dèanar mion-sgrùdadh.Airson mion-sgrùdadh sgapaidh aotrom, chaidh 150 µl de shamhlaichean a luchdachadh air microplates 96-tobar neo-cheangailteach (µClear®, dubh, F-Bottom / Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, an Ostair) agus còmhdaichte le film adhesive.Chaidh sùil a chumail air LLPan le bhith a’ tomhas sùghaidh aig 350 nm aig meadhan an fhuasglaidh ann an leughadair truinnsear CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, A’ Ghearmailt).Chaidh na deuchainnean a dhèanamh ann an trì-fhillte aig 25 ° C, agus chaidh na mearachdan a thomhas mar an claonadh àbhaisteach bhon mheadhan.Chaidh an ìre lag a thomhas le centrifugation sampall agus mion-sgrùdadh gel SDS-PAGE, agus chaidh am bloigh αS anns na h-ìrean caol agus dlùth a thomhas ann an grunn fhuasglaidhean LLPS.Chaidh sampall 100 μl LLPS anns an robh 1 μM AF488-label αS ullachadh le measgachadh mionaideach agus an uairsin centrifugation aig 9600 × g airson 30 mionaidean, agus às deidh sin bha an sileadh mar as trice ri fhaicinn.Chaidh an 50 μl as àirde den supernatant a chleachdadh airson tomhas pròtain a’ cleachdadh gel SDS-PAGE.Chaidh gels a sganadh le sìoltachain AF488 a’ cleachdadh siostam ìomhaighean gel ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) no air a dhath le stain Coomassie agus air a dhealbhadh le sìoltachain iomchaidh.Chaidh na bannan a thàinig às a sin a sgrùdadh a’ cleachdadh ImageJ dreach 1.53i (Institiudan Nàiseanta Slàinte, na SA).Chaidh na deuchainnean a dhèanamh ann an dà-fhillte ann an dà dheuchainnean eadar-dhealaichte le toraidhean co-chosmhail.
Mar as trice, chaidh 150 μl de shamhlaichean a chuir an sàs ann am microplates 96-tobar neo-cheangailteach agus chaidh am faicinn aig teòthachd an t-seòmair air miocroscop inverted Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, A’ Ghearmailt).Airson deuchainnean spot, chaidh pleitean µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, a’ Ghearmailt) no microplates polystyrene 96-tobar (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) a chleachdadh cuideachd.Chaidh lampaichean halide meatailt halogen no airgead-beò EL6000 a chleachdadh mar stòran soillseachaidh (airson ìomhaighean BF / DIC agus WF, fa leth).Airson microscopy WF, chaidh amas adhair meudachaidh 40x (Leica Microsystems, a 'Ghearmailt) a chleachdadh gus an solas a chuimseachadh air an sampall agus a chruinneachadh.Airson sampaill le bileagan AF488 agus ThT, sìoltachain excitation agus sgaoilidhean le seataichean sìoltachaidh GFP àbhaisteach, sìoltachain pas-còmhlain excitation agus sgaoilidhean, fa leth, sìoltachain bann-còmhlain 460–500 nm agus 512–542 nm, agus sgàthan dichroic 495 nm.Airson sampaill le bileagan le Atto647N, chaidh seata àbhaisteach de shìoltachain Cy5 le sìoltachain pas-còmhlain excitation agus sgaoilidhean 628–40 nm agus 692–40 nm, fa leth, agus sgàthan dichroic 660 nm a chleachdadh.Airson microscopy BF agus DIC, cleachd an aon amas cruinneachaidh solais le sgàthan.Chaidh an solas cruinnichte a chlàradh air camara CCD Leica DFC7000 (Leica Microsystems, a’ Ghearmailt).B’ e an ùine nochdaidh 50 ms airson ìomhaighean microscopy BF agus DIC agus 20-100 ms airson ìomhaighean microscopy WF.Airson coimeas a dhèanamh, b’ e 100 ms an ùine nochdaidh airson a h-uile deuchainn le ThT.Chaidh deuchainnean ùine a dhèanamh gus co-mheasadh droplet fhaicinn, le ìomhaighean gan cruinneachadh gach 100 ms airson grunn mhionaidean.ImageJ (NIH, USA) air a chleachdadh airson mion-sgrùdadh ìomhaighean.Chaidh na deuchainnean a dhèanamh ann an trì-fhillte le toraidhean co-chosmhail.
Airson deuchainnean colocalization, FRAP agus ath-thogail 3D, chaidh ìomhaighean fhaighinn air miocroscop confocal inverted Zeiss LSM 880 a’ cleachdadh deasachadh gorm ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, A’ Ghearmailt).Chaidh sampaill de 50 µl a chuir an sàs ann an soithichean µ-Slide Angiogenesis Petri (Ibidi GmbH, Gröfelfing, a’ Ghearmailt), air an làimhseachadh le polymer hydrophilic (ibiTreat) agus air an cur suas ann an amas bogaidh ola 63 × (Plan-Apochromat 63 × / NA 1.4 Oil) air DIC).Chaidh dealbhan fhaighinn le bhith a’ cleachdadh loidhnichean laser argon 458 nm, 488 nm, agus 633 nm le rùn de 0.26 µm / piogsail agus ùine nochdaidh de 8 µs / piogsail airson uinneagan lorg excitation agus sgaoilidhean de 470–600 nm, 493–628 nm, agus chaidh 638 – 755 nm a chleachdadh gus ThT, AF488 agus Atto647N fhaicinn, fa leth.Airson deuchainnean FRAP, chaidh dealbhan ùine de gach sampall a chlàradh aig frèam 1 gach diog.Chaidh na deuchainnean a dhèanamh trì-fhillte aig teòthachd an t-seòmair le toraidhean co-chosmhail.Chaidh na h-ìomhaighean uile a sgrùdadh a’ cleachdadh bathar-bog deasachadh gorm Zen 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, a’ Ghearmailt).Chaidh na lùban FRAP a dhèanamh àbhaisteach, a dhealbhadh agus a chuir a-steach gu dàta dian / ùine a chaidh a thoirt a-mach à ìomhaighean a ’cleachdadh Zen 2 a’ cleachdadh OriginPro 9.1.Chaidh na lùban ath-bheothachaidh a chuir a-steach do mhodal mono-exponential gus cunntas a thoirt air sgaoileadh moileciuil le teirm eas-chruthach a bharrachd gus cunntas a thoirt air buaidh sèididh togail.An uairsin rinn sinn cunntas air D a’ cleachdadh an radius sèididh ainmichte agus an leth-bheatha ath-bheothachaidh a chaidh a dhearbhadh roimhe seo mar a tha ann an co-aontar Kang et al.5 35 air a thaisbeanadh.
Chaidh atharrachaidhean cysteine ​​singilte de αS a cho-chur le 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) aig dreuchdan 24 (TEMPOL-24-αS) agus 122 (TEMPOL-122-αS), fa leth.Labeling Spin Airson deuchainnean EPR, chaidh an dùmhlachd αS a shuidheachadh aig 100 μM agus bha an dùmhlachd PEG aig 15% (w / v).Airson diofar shuidheachaidhean cruinneachaidh, bha an co-mheas αS: pLK aig 1:10, agus chaidh na co-mheasan αS: ΔNt-Tau agus αS: Tau441 a chumail aig 1: 1.Airson deuchainnean teannachaidh ceangail às aonais cruinneachadh, chaidh TEMPOL-122-αS a chumail aig 50 μM agus chaidh polycations a thoirt a-steach aig ìrean àrdachadh, ag ullachadh gach suidheachadh fa leth.Chaidh tomhasan CW-EPR a dhèanamh a’ cleachdadh speactrometer Bruker ELEXSYS E580 X-band uidheamaichte le resonator Bruker ER4118 SPT-N1 ag obair aig tricead microwave (SHF) de ~ 9.7 GHz.Tha an teòthachd air a shuidheachadh aig 25 ° C agus air a smachdachadh le cryostat nitrigin leaghaidh.Chaidh an speactram fhaighinn fo chumhachan neo-shàthaichte aig cumhachd MW de 4 mW, leud atharrachaidh de 0.1 mT, agus tricead atharrachaidh de 100 kHz.Chaidh dianan speactram a dhèanamh àbhaisteach gus eadar-dhealachaidhean ann an dùmhlachdan snìomh a sheachnadh eadar sampaill agus lughdachadh snìomh a dh’ fhaodadh a bhith ann mar thoradh air dùmhlachdan air fhàgail de riochdairean lughdachadh ann an sampallan anns an robh Tau441 no ΔNt-Tau (an làthair anns na fuasglaidhean pròtain tùsail).Chaidh na luachan ainmichte de g fhaighinn mar thoradh air modaladh speactram EPR a chaidh a dhèanamh a’ cleachdadh bathar-bog Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) a chaidh a chuir an gnìomh ann am Matlab®67.Chaidh modalan isotropic aon / dhà a chleachdadh gus an dàta a mhodaladh.Às deidh a h-uile comharra a dhèanamh àbhaisteach, chaidh na tha air fhàgail a thomhas le bhith a’ toirt air falbh gach atharrais bhon speactram deuchainneach co-fhreagarrach.Airson mion-sgrùdadh teannachaidh ceangail, chaidh dian coimeasach an treas còmhlan ris an dàrna còmhlan den speactram àbhaisteach EPR (IIII/III) a chleachdadh gus sùil a chumail air ceangal polycations ri αS.Gus tuairmse a dhèanamh air a’ sheasmhachd dissociation (Kd), chaidh an lùb a thàinig às a sin a chuir a-steach do mhodail tuairmseach a’ gabhail ris gu robh n làraich ceangail co-ionann agus neo-eisimeileach.
Chaidh deuchainnean speactroscopaidh NMR a dhèanamh a’ cleachdadh speactrometer NMR Bruker Neo 800 MHz (1H) uidheamaichte le cryoprobe agus Z-gradient.Chaidh a h-uile deuchainn a dhèanamh a’ cleachdadh 130 – 207 µM αS agus co-ionann αS / ΔNt-Tau agus pLK ann an 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 agus chaidh an coileanadh aig 15 ° C.Gus sùil a chumail air LPS le NMR, chaidh 10% PEG a chur ris na sampallan ro-mheasgaichte.Tha an cuilbheart perturbation gluasad ceimigeach (Fig. 1b) a 'sealltainn cuibheasachd gluasad ceimigeach 1H agus 15N.Chaidh an speactra αS 2D1H-15N HSQC a shònrachadh stèidhichte air sònrachadh roimhe (inntrigeadh BMRB #25227) agus chaidh a dhearbhadh le bhith a’ clàradh agus a’ sgrùdadh speactram 3D de HNCA, HNCO agus CBCAcoNH.Chaidh gluasadan ceimigeach 13Cα agus 13Cβ a thomhas an làthair ΔNt-Tau no pLK gus atharrachaidhean a dh’ fhaodadh a bhith ann an gluasadan structar àrd-sgoile a thomhas an coimeas ri gluasadan ceimigeach αS ann an co-chòrdadh coil air thuaiream fìor 68 (Figear Leasachail 5c).Chaidh na h-ìrean R1ρ a thomhas le bhith a’ clàradh dheuchainnean hsqctretf3gpsi (fhaighinn bho leabharlann Bruker) le dàil de 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, agus 800 ms, agus chaidh na gnìomhan eas-chruthach atharrachadh a rèir an dàil as àirde aig diofar ìrean. amannan gus an R1ρ agus a mhì-chinnt deuchainneach a dhearbhadh.
Chaidh deuchainnean microscopy fluorescence le fuasgladh ùine dà-dath a dhèanamh air miocroscop fluorescence fluorescence MT200 malairteach le fuasgladh ùine (PicoQuant, Berlin, a’ Ghearmailt) le inneal cunntais photon singilte co-cheangailte ri ùine (TCSPC).Tha an ceann laser diode air a chleachdadh airson excitation interleaved pulsed (PIE), bidh an giùlan a ’dol tro stiùireadh tonn aon mhodh agus air a ghleusadh gu cumhachd laser de 10 gu 100 nW airson loidhnichean laser 481 nm agus 637 nm air a thomhas às deidh sgàthan dichroic.Bidh seo a’ dèanamh cinnteach gu bheil an ìre cunntaidh photon as fheàrr, a’ seachnadh buaidhean aliasing photon, photobleaching agus sùghaidh.Chaidh bileagan-còmhdaich no truinnsearan μ-Slide angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, a’ Ghearmailt) a chuir gu dìreach ann an uisge bogaidh thairis air lionsa Super Apochromat 60x NA 1.2 le collar ceartachaidh (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Chaidh sgàthan dichroic 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, USA) a chleachdadh mar am prìomh inneal-sgoltadh beam.Tha rèididheachd neo-chuimseach air a bhacadh le toll le trast-thomhas de 50 micron, agus an uairsin tha an rèididheachd fòcas air a roinn ann an 2 shlighe lorg le inneal-sgoltadh giùlan 50/50.Chaidh sìoltachain sgaoilidh bann-leathann (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 airson dath uaine (AF488) agus 690/70 airson dath dearg (Atto647N) a chleachdadh air beulaibh an lorgaire.Chaidh diodes maoim-sneachda aon-photon (SPAD) (Innealan Micro Photon, Bolzano, an Eadailt) a chleachdadh mar lorgairean.Chaidh an dà chuid cruinneachadh dàta agus mion-sgrùdadh a dhèanamh a’ cleachdadh bathar-bog SymphoTime64 a tha ri fhaighinn gu malairteach (PicoQuant GmbH, Berlin, a’ Ghearmailt).
Chaidh leth-cheud microliters de shamhlaichean LLPS a chuir an sàs ann an tobraichean angiogenesis μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, a’ Ghearmailt).Tha na h-ìomhaighean a thig às a’ cuimseachadh gu 20 µm os cionn bonn an tobair airson an astar obrach amas as fheàrr airson boinneagan crochte agus gu ~ 1 µm airson ràthan agus dotagan le rùn axial de co-dhiù 0.25 µm / piogsail agus ùine dàil de 400 µs / piogsail.Tagh dàta le bhith a’ cur an sàs stairsneach dian stèidhichte air dian chomharran cùl-raoin cuibheasach (PBG, mean + 2σ) airson gach seanail gus nach tèid ach boinneagan pròtain liùlach, ràthan, no spotan a thaghadh, a’ sìoladh a-mach tùs sam bith bhon ìre sgapte.Gus sgrùdadh a dhèanamh air beatha gach gnè (τ) de gach seanal (uaine, “g” airson AF488 agus dearg, “r” airson Atto647N), thagh sinn roinnean inntinneach (ROI) anns an robh boinneagan, ràthan, no spotan (Figear Leasachail 1). ).8b).Cuibheasach τ bho τ .Chaidh ROIs a thug a-mach ro bheag de photons airson uidheamachadh ioma-exponential a chuir a-mach às an anailis.B’ e an gearradh dheth a chaidh a chleachdadh <104 photons airson ràthan is dotagan agus 103 airson boinneagan.Tha stairsneach nas ìsle aig na boinneagan oir tha e duilich lùban lobhadh fhaighinn le luachan dian nas àirde, leis gu bheil na boinneagan ann an raon nan ìomhaighean mar as trice nas lugha agus nas lugha.Chaidh ROI le cunntasan photon os cionn na crìche cruinneachaidh photon (suidhichte gu> 500 cunntadh / piogsail) a chuir air falbh cuideachd airson mion-sgrùdadh.Dèan maids eadar an lùb lobhadh dian a gheibhear bhon roinn ùidh le dian aig 90% den ìre as àirde (beagan às deidh an dian as motha den chrìonadh) bho thoiseach beatha na seirbheis gus dèanamh cinnteach à glè bheag de bhuaireadh IRF fhad ‘s a chumas tu an aon rud airson a h-uile lobhadh dian. suidheachaidhean Uinneag ùine coimeasach Chaidh mion-sgrùdadh a dhèanamh air 25 gu 50 ROI airson ràthan agus spotan agus 15-25 ROI airson boinneagan, chaidh ìomhaighean a thaghadh bho barrachd air 4 mac-samhail a chlàradh bho co-dhiù 3 deuchainnean neo-eisimeileach.Chaidh deuchainnean t dà-earball a chleachdadh gus eadar-dhealachaidhean staitistigeil eadar gnèithean no eadar siostaman coacervate a mheasadh.Airson mion-sgrùdadh piogsail-air-piogsail den bheatha (τ), chaidh lasachadh iomlan na beatha thar an raoin airson gach seanail a thomhas agus chaidh tuairmse a dhèanamh air modal lasachaidh eas-chruthach 2/3-component.Chaidh an lasachadh fad-beatha airson gach piogsail an uairsin a chuir a-steach a’ cleachdadh luachan τ a chaidh a thomhas roimhe, agus mar thoradh air sin thàinig ìomhaigh iomchaidh pseudocolor FLIM.Bha an raon fad-beatha freagarrach airson earbaill an aon rud thar gach ìomhaigh den aon seanal, agus thug gach lobhadh a-mach gu leòr photons gus freagairt earbsach a thoirt seachad.Airson mion-sgrùdadh FRET, chaidh piogsail a thaghadh le bhith a’ cur a-steach stairsneach dian nas ìsle de 100 photons, aig an robh cuibheasachd comharra cùl-fhiosrachaidh (FBG) de 11 photons.Chaidh dian fluorescence gach seanail a cheartachadh le factaran ceartachaidh a chaidh a dhearbhadh gu deuchainneach: bha 69 spectral crosstalk α 0.004, excitation dìreach β bha 0.0305, bha èifeachdas lorgaidh γ aig 0.517.Tha èifeachdas FRET aig ìre piogsail an uairsin air a thomhas leis a’ cho-aontar a leanas:
far a bheil FDD mar an dian fluorescence a chaidh fhaicinn anns an t-sianal tabhartais (uaine), is e FDA an dian fluorescence a chaidh fhaicinn anns an t-sianal glacadair (dearg) fo excitation neo-dhìreach, agus is e FAA an dian fluorescence a chaidh fhaicinn anns an t-sianal glacadair (dearg) fo excitation dìreach. PIE).Thathas a’ cumail sùil air buillean dian fluorescence anns an t-sianal).
Cuir 100 µl de fhuasglaidhean ath-bhualadh LLPS anns a bheil 25 µM monomeric Tau441 gun ainm (le no às aonais 25 µM αS) ann am bufair LLPS (leasaichte mar gu h-àrd) air microplates 96-tobar neo-cheangailteach le còmhdach foil adhesive agus chaidh cruthachadh droplet a sgrùdadh le WF microscopy às deidh sin cothromachaidh.taobh a-staigh 10 mionaidean.Às deidh 48 uair de ghoir aig teòthachd an t-seòmair, chaidh làthaireachd ràthan pròtain agus spotan a dhearbhadh.An uairsin thoir air falbh gu faiceallach an leaghan thairis air na ràthan bho na tobraichean, an uairsin cuir 50 L de bufair dissociation (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) agus goir airson 10 mionaidean.Tha an dùmhlachd àrd salainn a’ dèanamh cinnteach nach bi LLPS a-rithist mar thoradh air PEG a tha air fhàgail, agus thèid co-chruinneachaidhean pròtain a dh’ fhaodadh a bhith air an cruthachadh dìreach le eadar-obrachaidhean electrostatach a chuir às a chèile.Chaidh bonn an tobair an uairsin a sgrìobadh gu faiceallach le tip micropipette agus chaidh am fuasgladh a thàinig às a sin a ghluasad gu tobar amharc falamh.Às deidh na sampallan a thoirt a-steach le 50 μM ThT airson 1 h, chaidh làthaireachd spotan iomallach a sgrùdadh le microscopy WF.Ullaich fibrilean αS sonicated le bhith a’ toirt a-steach 300 µl de fhuasgladh 70-µM αS ann am PBS le pH 7.4, sodium azide 0.01% aig 37 ° C agus 200 rpm air crathadh orbital airson 7 latha.Chaidh am fuasgladh an uairsin a chuir a-steach aig 9600 × g airson 30 min, chaidh am pellet a chuir air ais ann am PBS pH 7.4 agus sonicated (1 min, cearcall 50%, leudachd 80% ann an sonicator Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, USA) sampaill fibril le cuairteachadh meud coimeasach de fhibrilean beaga.
Chaidh mion-sgrùdadh FCS / FCCS agus lorg co-thuiteamas dà-dath (TCCD) a dhèanamh air an aon mhiocroscop fluorescent fuasgladh-ùine MT200 (Pico-Quant, Berlin, A’ Ghearmailt) a chaidh a chleachdadh airson deuchainnean microscopy FLIM-FRET a’ cleachdadh modh PIE.Chaidh an cumhachd laser airson nan deuchainnean sin a chur ri 6.0 µW (481 nm) agus 6.2 µW (637 nm).Chaidh an cothlamadh de na cumhachdan laser sin a thaghadh gus soilleireachd coltach ris a thoirt gu buil airson na paidhrichean de fluorophores a chaidh a chleachdadh fhad ‘s a bha iad a’ coileanadh ìrean cunntais as fheàrr agus a ’seachnadh photobleaching agus sùghaidh.Chaidh an dà chuid cruinneachadh dàta agus mion-sgrùdadh a dhèanamh a’ cleachdadh bathar-bog SymphoTime64 dreach 2.3 a tha ri fhaighinn gu malairteach (PicoQuant, Berlin, a’ Ghearmailt).
Tha sampaill de cho-chruinneachaidhean iomallach αS / Tau a gheibhear le bhith a’ cleachdadh LLPS air an lagachadh ann am bufair aonaranachd chun an dùmhlachd monomolecular iomchaidh (mar as trice caolachadh 1: 500, leis gu bheil cruinneachaidhean mar-thà aig dùmhlachd ìosal nuair a tha iad air an dealachadh bho shampaill coacervate).Chaidh sampaill a chuir an sàs gu dìreach air còmhdach-còmhdaich (Corning, USA) air a ro-chòmhdach le fuasgladh BSA aig dùmhlachd de 1 mg / mL.
Airson mion-sgrùdadh PIE-smFRET anns na seanalan uaine is dearg, chaidh stairsneach dian nas ìsle de 25 photons a chuir an sàs gus comharran dian ìosal adhbhrachadh le tachartasan monomeric a shìoladh (thoir an aire gu bheil monomers nas àirde na sampallan iomlan an coimeas ri cruinneachaidhean iomallach).Chaidh an stairsneach seo a thomhas mar chòig uiread an dian cuibheasach de monomeric αS a fhuaireadh bho sgrùdadh sampaill monomer fìor-ghlan gus cruinneachaidhean a thaghadh gu sònraichte airson mion-sgrùdadh.Tha an cuairteachadh dràibhidh PIE, còmhla ri togail dàta TSCPC, air leigeil le sìoltachan cuideam fad-beatha a chuir an sàs a chuidicheas le bhith a’ cuir às do chùl-raon agus crosstalk speactram.Chaidh an dian lasadh a chaidh a thaghadh a’ cleachdadh nan stairsnich gu h-àrd a cheartachadh le bhith a’ cleachdadh a’ chomharra cùil cuibheasach a chaidh a dhearbhadh bho na histograman tachartais an aghaidh dian/bin de na sampallan bufair a-mhàin.Mar as trice bidh spreadhaidhean co-cheangailte ri cruinneachaidhean mòra ann an grunn bhionaichean an dèidh a chèile san t-slighe ùine (suidhichte gu 1 ms).Anns na cùisean sin, chaidh biona den neart as àirde a thaghadh.Airson mion-sgrùdadh FRET agus stoichiometric, chaidh am bàillidh gamma γ (0.517) a chaidh a dhearbhadh gu teòiridheach a chleachdadh.Tha crosstalk speactram agus tabhartasan brosnachaidh dìreach glè bheag (air a dhearbhadh gu deuchainneach) aig a’ chumhachd laser excitation a thathar a ’cleachdadh.Tha èifeachdas agus stoichiometry FRET ann an spreadhadh air a thomhas mar a leanas.