ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Tube Welded Duplex airson pàirt ceimigeach Gnìomhachas Ceimigeach, Tha easbhaidh SPECC1L a’ leantainn gu barrachd seasmhachd ann an joints spliced ​​agus lughdachadh lughdachadh de cheallan suaicheantas neural cranial.

Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com.Tha thu a’ cleachdadh dreach brobhsair le taic CSS cuibhrichte.Airson an eòlas as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu brobhsair ùraichte (no cuir à comas Modh Co-chòrdalachd ann an Internet Explorer).A bharrachd air an sin, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, bidh sinn a 'sealltainn an làrach gun stoidhlichean agus JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube airson gnìomhachas ceimigeach

Tha Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.na phrìomh neach-saothrachaidh a tha speisealaichte ann am pìoban fuaigheil stàilinn gun staoin, tiùban soilleir annealed, tubing coiled fuaigheil msaa.Gus luchd-ceannach a dhèanamh comasach, tha sinn air pìoban agus pìoban a thàthadh cuideachd.Tha Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.aig a bheil an uidheamachd toraidh is deuchainn as adhartaiche.Is urrainn dhuinn do riatanas a shàsachadh gu tur.A rèir na h-ìre gu math teann, bidh fulangas OD agus WT ceart aig na tiùban a rinn sinn an-còmhnaidh.Tha an smachd fulangas a rèir inbhean toraidh.Tha na stuthan againn an-còmhnaidh riaraichte le luchd-ceannach.Cheannaich luchd-ceannach na toraidhean againn barrachd prothaidean.
a) OD (Trast-thomhas a-muigh): 3.18mm gu 101.6mm
b) WT (Tighead balla): 0.5mm gu 20mm
c) Fad: A rèir riatanas luchd-ceannach
d) Inbhean: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 etc
e) Modh Pròiseas: ERW, EFW msaa

Sleamhnagan a’ sealltainn trì artaigilean gach sleamhnag.Cleachd na putanan air ais is air adhart gus gluasad tro na sleamhnagan, no na putanan rianadair sleamhnag aig an deireadh gus gluasad tro gach sleamhnag.
Bidh na ceallan suaicheantas neural cranial (CNCC) a’ slaodadh far na pasgain neural embryonach agus a’ gluasad gu na boghachan pharyngeal, a tha a’ dèanamh suas a’ mhòr-chuid de na structaran midface.Tha pàirt cudromach aig dysfunction CNCC ann an etiology de orofacial cleft, droch-chruth congenital cumanta.Chaidh mùthaidhean heterozygous SPECC1L a lorg ann an euslaintich le sgoltagan neo-àbhaisteach agus sionndromanach.An seo, tha sinn ag aithris air staining leasaichte de cho-phàirtean snaim adhesive canonical (AJ), β-catenin agus E-cadherin ann an ceallan crathaidh SPECC1L cultarach, agus tha micrographs dealanach a’ nochdadh sgaoileadh apical-basal de AJ.Gus tuigse fhaighinn air àite SPECC1L ann am morphogenesis craniofacial, chruthaich sinn modal luchag easbhaidheach Specc1l.Tha mutants homozygous nan embryonach marbhtach agus a’ nochdadh dùnadh tiùba neural le lagachadh agus lamination CNCC.Tha staining pròtain AJ air a mheudachadh ann am pasganan neural mutant.Tha an locht AJ seo co-chòrdail ri uireasbhaidh ann an delamination CNCC, a dh’ fheumas sgaoileadh AJ.A bharrachd air an sin, tha Specc11 mutants air comharran PI3K-AKT a lughdachadh agus air apoptosis àrdachadh.In vitro, bha casg tlàth air comharran PI3K-AKT ann an ceallan seòrsa fiadhaich gu leòr gus atharrachaidhean AJ a bhrosnachadh.Gu cudromach, faodar atharrachaidhean AJ air adhbhrachadh le leagail SPECC1L a thionndadh air ais le bhith a’ cur an gnìomh slighe PI3K-AKT.Air an gabhail còmhla, tha an dàta seo a’ nochdadh gu bheil feum air SPECC1L, mar riaghlaiche ùr air comharran PI3K-AKT agus bith-eòlas AJ, airson dùnadh tiùban neural agus srath CNCC.
Bidh ceallan suaicheantas neural cranial (CNCCn) a’ tighinn gu h-ionadail don neuroectoderm dorsal agus a’ dealachadh bhon neuroepithelium de na pasgain neural a tha a’ leasachadh tro phròiseas anns a bheil an gluasad epithelial-mesenchymal (EMT) 1,2,3.Bidh CNCCn epithelial premigrating a’ cur dragh air cinn-rathaid eadar-cheallach agus a’ tighinn gu bhith nan CNCCn mesenchymal imrich a bhios a’ lìonadh a’ chiad agus an dàrna boghan pharyngeal agus a’ dèanamh suas a’ mhòr-chuid de na maoth-chnàimh craniofacial.Mar sin, bidh ginean a bhios a’ riaghladh gnìomh CNCC gu tric air am buaireadh ann an etiology neo-riaghailteachdan congenital craniofacial leithid sgoltadh orofacial, mar as trice a’ toirt buaidh air breith 1/800 anns na SA a-mhàin.Aon de na deformities congenital8.
Tha delamadh an CNCC a’ tachairt aig an aon àm ri dùnadh an tiùba neural roimhe eadar 8.5 agus 9.5 latha de leasachadh embryo ann an luchagan.Bidh mutants de ghrunn ghinean co-cheangailte ri sgoltadh lucha cuideachd a’ nochdadh seòrsa air choreigin de locht tiùb neòil, a’ toirt a-steach Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, agus Pdgfrα12.Ach, faodar beachdachadh air pròiseasan dùnadh tiùba neural agus sreathadh CNCC neo-eisimeileach, leis gu bheil an luchag mutant Splotch (Pax3) a’ taisbeanadh uireasbhaidhean ann an dùnadh tiùb neòil gun bhuaidh sam bith air sreathadh CNCC no imrich 13,14.Cuidichidh modalan lucha a bharrachd le uireasbhaidhean ann an sgaradh CNCC agus dùnadh tiùb neural gus bunait moileciuil coitcheann an dà phròiseas seo a mhìneachadh.
Tha dealachadh CNCC bho cheallan neuroepithelial ag iarraidh gun tèid cinn-rathaid adhesive (AJs) a sgaoileadh, a tha air an dèanamh suas de cho-fhilltean pròtain anns a bheil, am measg feadhainn eile, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, agus α-actinin co-cheangailte ri actin filaments 2 Sheall sgrùdaidhean overexpression E-cadherin ann am pasganan neural lùghdachadh no dàil ann an delamination CNCC.Air an làimh eile, bidh cuir às do E-cadherin a’ leantainn gu sreathadh tràth15,16.Is e factaran tar-sgrìobhaidh (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) agus matrix extracellular (ECM) pròtanan ath-dhealbhachaidh leithid matrix metalloproteinases (MMPn) a th’ ann am mòran de na factaran a tha a’ meadhanachadh EMT rè sreathadh CNCC, ach tha CNCCn nan riaghladairean AJ cytoskeletal dìreach. nach eil fios fhathast.Tha fios gu bheil slighe PI3K-AKT a’ dol an aghaidh ìrean E-cadherin, gu h-àraidh bho rannsachadh aillse17.Tha sgrùdaidhean o chionn ghoirid air sealltainn gu bheil call comharran PI3K-AKT stèidhichte air PDGFα ann an luchagan a’ leantainn gu ana-cainnt craniofacial, a’ toirt a-steach palate sgolt agus lochdan tiùb neòil12.Ach, chan eil an dàimh eadar slighe PI3K-AKT agus seasmhachd AJ air sreathadh CNCC soilleir.
Chomharraich sinn roimhe SPECC1L mar a’ chiad ghine mutant ann an dithis le sgoltadh cruaidh a tha a’ sìneadh bhon bheul chun na sùla, ris an canar oblique cleft (ObFC) no Tessier IV18 cleft.Chaidh mùthaidhean SPECC1L a chomharrachadh ann an dà theaghlach ioma-ghinealach leis an t-syndrome Opitz G/BBB ceannasach fèin-ghluasadach (OMIM #145410), anns an robh daoine fa leth air an robh buaidh a’ nochdadh mòr-astar agus bilean / palate19, agus ann an aon teaghlach le syndrome Tibi overdistance (OMIM #145420)20 .tha còrr air leth de chùisean syndrome Opitz G/BBB ceangailte le X (OMIM #300000) agus air adhbhrachadh le mùthaidhean ann an gine MID1, a tha a’ còdachadh pròtain 22 den chnàmhan cealla co-cheangailte ri microtubule.Tha sinn a’ gabhail beachd gum faodadh SPECC1L, cuideachd pròtain co-cheangailte ri microtubules agus an actin cytoskeleton, meadhanachadh a dhèanamh air comharran a tha riatanach airson ath-dhealbhadh actin cytoskeleton aig àm gèilleadh cealla agus imrich 18 .Tro sgrùdaidhean in vitro agus in vivo, tha sinn a-nis a’ toirt cunntas air SPECC1L mar riaghladair ùr air seasmhachd AJ tro chomharran PI3K-AKT.Aig an ìre cealla, dh’ adhbhraich easbhaidh SPECC1L lùghdachadh ann an ìre a’ phròtain pan-AKT agus àrdachadh ann an sgapadh apical-basal de AJ, a chaidh a chuir às le gnìomhachadh ceimigeach air slighe AKT.Ann am vivo, tha embryos Specc11-easbhaidh a’ nochdadh dùnadh tiùba neural le lagachadh agus gearradh sìos CNCC.Mar sin, tha SPECC1L ag obair ann an comharran stèidhichte air gleusadh cealla làn-riaghlaichte a tha riatanach airson gnìomh àbhaisteach CNCC rè morphogenesis aghaidh.
Gus àite SPECC1L aig ìre cealla a chomharrachadh, chleachd sinn an loidhne cealla osteosarcoma seasmhach U2OS a bha easbhaidheach ann an SPECC1L18.Bha lùghdachadh meadhanach (60-70%) aig na ceallan seasmhach U2OS seo le leagail SPECC1L (kd) anns na h-ìrean de thar-sgrìobhaidhean SPECC1L agus pròtanan, còmhla ri lochdan ann an imrich agus ath-eagrachadh an actin cytoskeleton 18. An coimeas ri sin, lùghdachadh mòr neo-ghluasadach ann an Thathas air sealltainn gu bheil SPECC1L a’ leantainn gu uireasbhaidhean mitotic 23 .Às deidh barrachd caractarachadh, lorg sinn gun do dh’ atharraich na ceallan seasmhach SPECC1L-kd againn morf-eòlas aig ìre glè àrd de chomar (Figear 1).Bha ceallan smachd fa leth agus ceallan kd aig comar ìosal a’ coimhead coltach (Figear 1A, D).24 uairean an dèidh fusion, ghlèidh ceallan smachd an cumadh ciùbach (Fig. 1B, E), fhad 'sa bha ceallan SPECC1L-kd a' leudachadh (Fig. 1C, F).Chaidh ìre an atharrachaidh seo ann an cumadh cealla a ghlacadh le ìomhaighean beò in vivo de cheallan smachd agus ceallan kd (film 1).Gus àite SPECC1L ann an ceallan confluent a dhearbhadh, rinn sinn sgrùdadh an-toiseach air a mhìneachadh.Fhuair sinn a-mach gun do dh'èirich ìrean pròtain SPECC1L nuair a thàinig iad còmhla (Figear 1G), ach cha do dh'èirich ìrean tar-sgrìobhaidh SPECC1L (Figear 1H).A thuilleadh air an sin, mar a bha dùmhlachd cealla a 'dol am meud, chruinnich pròtain SPECC1L aig crìochan eadar-cheallach (Fig. 2A-E), le pàtran a' dol thairis air pàtran β-catenin co-cheangailte ri membran (Fig. 2A'-E ').Leis an ceangal eadar SPECC1L agus an actin cytoskeleton 18,23 bha sinn a’ smaoineachadh gu bheil SPECC1L ag eadar-obrachadh le cinn-rathaid adhesive stèidhichte air actin (AJ).
(AF) Bidh ceallan leagail SPECC1L (DF) a’ leudachadh aig comar àrd (F) an coimeas ri smachd air ceallan U2OS (AC).Air an sealltainn an seo tha trì de na sia puingean ùine (T1, T3, T6) a thagh sinn airson diofar dùmhlachd cealla.(G) Mion-sgrùdadh blot an iar a’ sealltainn gu bheil am pròtain SPECC1L air a dhèanamh seasmhach aig ìre àrd de chomar an coimeas ri ìre ìosal de chomar ann an ceallan smachd.Tha blot an iar de SPECC1L a ’sealltainn a’ chòmhlan 120 kDa ris a bheil dùil agus còmhlan cuideam moileciuil nas àirde, is dòcha air atharrachadh às deidh eadar-theangachadh (*).Chaidh mion-sgrùdadh blot an iar a dhèanamh fo na h-aon chumhachan airson comar ìosal agus àrd.Chaidh dealbhan a’ sealltainn SPECC1L aig comar ìosal is àrd a thoirt bhon aon bhuille.Chaidh an aon blot a thoirt air falbh agus ath-sgrùdadh le antibody β-actin.(H) Cha do sheall mion-sgrùdadh cainneachdail RT-PCR atharrachaidhean mòra ann an ìrean tar-sgrìobhaidh SPECC1L.Bidh bàraichean mearachd a’ riochdachadh SEMn bho cheithir deuchainnean neo-eisimeileach.
(AE) Thagh sinn sia puingean ùine (T1-T6) a 'riochdachadh raon de dhlùths cealla gus mion-sgrùdadh cumadh cealla a dhèanamh àbhaisteach agus atharrachaidhean AJ ann an ceallan U2OS le leagail SPECC1L (kd).Bha a’ chiad còig de na puingean ùine sin a’ toirt a-steach ceallan singilte (T1), 50-70% fusion de chruinneachaidhean cealla beaga (T2), fusion gun ath-dhealbhadh kd ceallan (T3), ath-dhealbhadh cheallan kd (T4), agus atharrachaidhean 24 uair.ann an cruth posterior de cheallan kd (T5).Chaidh am pròtain SPECC1L a sgaoileadh sa mhòr-chuid anns an cytoplasm aig T1 (A), ach chaidh a chruinneachadh fhaicinn aig crìochan eadar-cheallach aig puingean ùine às deidh sin (B-E, saighdean).(FJ) Tha β-catenin a’ sealltainn cruinneachadh coltach ri chèile aig crìochan eadar-cheallach co-cheangailte ri iom-fhillte AJ.(A'-E') Tha SPECC1L agus β-catenin a’ nochdadh staining thar-tharraingeach aig crìochan cealla aig dùmhlachd cealla àrd (saigheadan).(F'-J ') Ann an ceallan SPECC1L-kd, tha staining β-catenin a’ nochdadh àbhaisteach aig dùmhlachd cealla ìosal (F’-H ’), ach a’ leudachadh mar atharrachaidhean cumadh cealla (I’, J ’; saigheadan), a’ nochdadh gu bheil AJ air atharrachadh.Bàraichean = 10 µm.
Dh’ fheuch sinn an uairsin ri faighinn a-mach dè a’ bhuaidh a bhiodh aig easbhaidh SPECC1L air AJ.Chleachd sinn grunn chomharran co-cheangailte ri AJ, a’ toirt a-steach na pàirtean canonical F-actin, myosin IIb, β-catenin, agus E-cadherin24,25,26,27.Mheudaich snàithleach cuideam actin ann an ceallan SPECC1L-kd mar a chaidh a mhìneachadh roimhe (Fig. 3A, B) 18 .Sheall Myosin IIb co-cheangailte ri filamentan actin àrdachadh co-chosmhail ann an ceallan SPECC1L-kd in vitro (Fig. 3C, D).Bidh β-catenin co-cheangailte ri AJ a’ ceangal ri cadherin aig an membran cealla, a’ sealltainn pàtran abairt àbhaisteach “honeycomb” ann an cubocytes smachd (Fig. 3E, G).Gu h-inntinneach, ann an ìomhaighean còmhnard a’ cleachdadh microscopy confocal, sheall β-catenin (Fig. 3E, F) agus E-cadherin (Fig. 3G, H) a’ staining air membran cealla cealla le easbhaidh SPECC1L pàtrain follaiseach de staining leudaichte.Bha an leudachadh seo air staining β-catenin co-cheangailte ri AJ ann an ceallan kd nas fhollaisiche aig comar, ach bha coltas ann gun robh e ro atharrachaidhean ann an cumadh cealla (Fig. 2F-J, F'-J').Gus nàdar fiosaigeach an staining AJ leudaichte seo a dhearbhadh, rinn sinn sgrùdadh air crìochan cealla air uachdar apical-basal de cheallan SPECC1L-kd U2OS le microscopaidh dealanach tar-chuir (TEM) (Figear 3I, J).Eu-coltach ri ceallan smachd (Fig. 3I), aig an robh roinnean dùmhail dealanach eadar-dhealaichte mar chomharra air AJ (saigheadan), sheall ceallan kd (Fig. 3J) roinnean mòra, faisg air làimh de dhlùths àrd dealanach a bha a’ nochdadh AJ air an itealan apicobasal..A bharrachd air an sin, air earrannan transverse, chunnaic sinn filleadh farsaing de memblan cealla ann an ceallan kd (Fig. S1A, B), a tha a’ mìneachadh pàtran leudaichte bannan staining β-catenin agus E-cadherin (Fig. 3F, H).Mar thaic do dhreuchd SPECC1L ann an AJn, chaidh β-catenin a cho-dhìonadh le SPECC1L ann an lysates de cheallan U2OS confluent (Fig. 3K).Còmhla ri dìonachd leudaichte airson comharran AJ, bha mion-sgrùdadh TEM co-chòrdail ris a’ bheachd-bharail againn gu bheil easbhaidh SPECC1L ag àrdachadh dùmhlachd agus caochlaidheachd AJ apical-basal.
(AH) Meudachadh air staining F-actin ann an ceallan kd aig 48 uair an dèidh fusion (T6; A, B).Atharrachadh air staining myosin IIb co-cheangailte ri F-actin (C, D).Chaidh am pàtran rèidh de staining membran β-catenin agus E-cadherin ann an ceallan smachd (E, G) a leasachadh ann an ceallan SPECC1L-kd (F, H).Bàraichean = 10 µm.(I-J) Micrografan dealanach a’ coimhead air an t-snaim eadar-cheallach apical-basal.Tha ceallan smachd a’ nochdadh roinnean sònraichte dùmhail le dealan a’ comharrachadh cinn-rathaid steigeach (I, saighdean).An coimeas ri sin, nochd an snaim apical-basal gu lèir ann an ceallan SPECC1L-kd dùmhail dealanach (J, saighdean), a’ nochdadh barrachd dùmhlachd agus sgapadh de chinn-rathaid adhesive.(K) Chaidh β-catenin a cho-dhìon le SPECC1L ann an lysates cealla U2OS confluent.Ìomhaigh air a thogail bho aon àite a’ riochdachadh aon de cheithir deuchainnean neo-eisimeileach.
Gus àite SPECC1L ann am morphogenesis craniofacial a thuigsinn, chruthaich sinn modal lucha easbhaidheach Specc1l a’ cleachdadh dà loidhne cealla ribe ES neo-eisimeileach, DTM096 agus RRH048 (BayGenomics, CA), a tha a’ riochdachadh intron 1 agus chaidh tar-sgrìobhaidhean Specc1l a ghlacadh aig 15 (Fig. 1). .4A, figear S2).Chaidh suidheachadh genomic an cuir a-steach vectar decoy a dhearbhadh le seicheamh genome slàn agus air a dhearbhadh le PCR (Fig. S2).Leig an dà dhealbhadh ribe gine cuideachd cothrom do luchd-aithris Specc11-lacZ a bhith air an glacadh ann am frèam.Mar sin, chaidh abairt lacZ a chaidh a dhearbhadh le staining X-gal a chleachdadh mar chomharradh air abairt Specc11.Sheall an dà alleles pàtrain faireachdainn lacZ co-chosmhail, leis an ribe gine DTM096 ann an intron 1 a’ nochdadh faireachdainn nas làidire na RRH048 ann an intron 15 (chan eil sin ri fhaicinn).Ach, tha Specc1l air a chuir an cèill gu farsaing, le faireachdainn sònraichte làidir anns na pasgain neural aig E8.5 (Figear 4B), anns an tiùb neural agus pròiseasan aghaidh aig E9.5 agus E10.5 (Figear 4C, D), agus ann a bhith a’ leasachadh buill-bodhaig aig E10.5 agus sùilean (Figear 4D).Dh’ innis sinn roimhe gu robh abairt SPECC1L anns a’ chiad bhogha pharyngeal aig E10.5 an làthair anns an epithelium agus mesenchyme18 fon talamh, a rèir loidhne CNCC.Gus deuchainn a dhèanamh air abairt SPECC1L ann an CNCC, rinn sinn pasgain neural E8.5 (Figear 4E-J) agus earrannan claigeann E9.5 (Figear 4K-).Aig E8.5, bha SPECC1L a’ dathadh pasgadh neural gu dian (Fig. 4E, H), a’ toirt a-steach ceallan air an dath le comharran NCC (Fig. 4G, J).Aig E9.5, SPECC1L (Fig. 4K, N) làidir dhathte imrich CNCC co-dhathach le AP2A (Fig. 4L, M) no SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Riochdachadh sgeamaigeach de ghine Specc11 na luchaige a’ sealltainn cuir a-steach vectar decoy ann an clones cealla ES DTM096 (intron 1) agus RRH048 (intron 15).(BD) staining lacZ de embryons heterozygous Specc1lDTM096 a’ riochdachadh abairt Specc1l bho E8.5 gu E10.5.NE = neuroectoderm, NF = filleadh neural, PA1 = a 'chiad bhogha pharyngeal.(EP) SPECC1L immunostaining le comharran NCC AP2A agus SOX10 ann am pasgain neural E8.5 (NF; EJ) agus earrannan claigeann E9.5 (KP).Chaidh staining SPECC1L fhaicinn gu farsaing ann am pasganan neural E8.5 (E, H; cinn-saighead), a’ toirt a-steach ceallan air an ainmeachadh le AP2A (F, G; cinn saighead) agus SOX10 (I, J; cinn saighead).Aig E9.5, SPECC1L làidir dhathte CNCCn imrich (K, N; saighdean) le bileag AP2A (L, M; saighdean) agus SOX10 (O, P; saighdean).
Le bhith a’ dol tarsainn eadar heterozygous Specc1lDTM096/+ agus Specc1lRRH048/+ tha luchagan a’ sealltainn nach eil an dà alleles ribe gine co-phàirteach agus gu bheil heterozygotes toinnte agus homozygotes embryonach airson an dàrna cuid allele ribe gine marbhtach embryonach (Clàr S1).Chomharraich co-mheasan Mendelian lùghdachadh ann an ìre mairsinneachd heterozygotes aig àm breith (1.34 an aghaidh 2.0 an dùil).Thug sinn fa-near bàsmhorachd ìosal am measg heterozygotes, bha neo-riaghailteachdan craniofacial aig cuid (Fig. S3).Ach, tha an ìre ìosal de na phenotypes craniofacial perinatal sin ga dhèanamh duilich sgrùdadh a dhèanamh air na h-innealan pathophysiologic bunaiteach aca.Mar sin, chuir sinn fòcas air an phenotype marbhtach embryonach de mutants homozygous Specc11.
Cha do leasaich a’ mhòr-chuid de embryons mutant heterozygous no homozygous Specc1lDTM096/RRH048 às deidh E9.5–10.5 (Figs. 5A–D), agus cha do dhùin an tiùb neural roimhe (Figs. 5B, D) agus uaireannan dhùin e nas fhaide air adhart (chan eil seo ri fhaicinn). ..Bha an uireasbhaidh dùnaidh tiùba neural cranial seo co-cheangailte ris a’ mhòr-chuid de CNCC comharraichte DLX2 air fhàgail anns na pasgain neural aig E10.5, a’ nochdadh nach robh sgaradh ann (Figear 5A’-D’).Gus faighinn a-mach an deach meud iomlan CNCC a lughdachadh cuideachd, chuir sinn tagaichean air loidhnichean CNCC le GFP anns na loidhnichean ribe gine againn le Wnt1-Cre agus ROSAmTmG.Bidh sinn a’ sruthadh GFP + NCC agus GFP- (RFP +) neo-NCC bho embryos slàn.Aig E9.5, cha do dh'atharraich a 'chuibhreann de CNCC le bileag GFP le bileag GFP gu mòr eadar WT agus embryos mutant (nach deach a shealltainn), a' comharrachadh sònrachadh àbhaisteach CNCC.Mar sin, bha sinn a’ smaoineachadh gun robh staining Wnt1-Cre agus DLX2 a bha air fhàgail ann am pasgain neural fosgailte (Figear 5B’) mar thoradh air laigheachadh CNCC easbhaidheach, is dòcha mar thoradh air barrachd dùmhlachd no sgapadh de cheallan AJ, mar a chithear ann an ceallan SPECC1L-kd.Chleachd sinn na comharran NCC SOX10, AP2A, agus DLX2 gus dearbhadh gu robh CNCC anns a’ phìos neural (Figear 5E-R).Aig E8.5, chaidh staining fold neural airson na trì comharran NCC fhaicinn ann an earrannan de WT (Fig. 5E, G, I) agus Specc1l mutant (Fig. 5F, H, J).Aig E9.5, fhad 'sa bha comharran NCC a' dathadh imrich NCC ann an earrannan WT (Fig. 5M, O, Q), chaidh staining NCC a bha air fhàgail fhaicinn ann am pasganan neònach fosgailte de embryons mutant Specc1l (Fig. 5N, P, R).Leis gu bheil SOX10 agus DLX2 a’ comharrachadh CNCCn imrich, tha an toradh seo a’ moladh gum bi CNCCn le dìth SPECC1L a’ coileanadh sònrachadh iar-imrich ach nach eil iad a’ gluasad bho fhilltean neural.
Tha easbhaidh Specc11 a’ leantainn gu dùnadh tiùba neural easbhaidheach, delamination de cheallan suaicheantas neural cranial agus AJn.
(A, B') E9.5 WT (A) Embryo a' giùlan ceallan suaicheantas neural cranial imrich (CNCC) air an ainmeachadh le Wnt1-Cre (A').An coimeas ri sin, tha embryos mutant Specc11 a’ nochdadh pasgain neural fosgailte (B), cinn saighead) agus CNCCn nach eil air imrich (B’, cinn-saighead).(C, D’) Ìomhaighean achaidh soilleir (C, D’) agus dìon dìon (C’, D’) den chomharra CNCC DLX2 de embryos E10.5 WT (C, C’) agus Specc1l (D, D’).Ann an embryos WT E10.5, bidh CNCC DLX2-positive a’ tuineachadh na boghachan gill (C’, saighdean), agus ann am mutants, bidh staining follaiseach a’ leantainn anns na pìosan fosgailte neural (D’, saigheadan) agus anns a’ chiad bhogha pharyngeal (D’, saighdean).) le beagan staining (saigheadan) a’ comharrachadh droch delamination agus imrich CNCC.ER) Chaidh earrannan de embryos mutant WT agus Specc1l aig ìrean E8.5 (E-L) agus E9.5 (M-R) a chomharrachadh le comharran NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) agus DLX2 (I, J, Q, R).Aig E8.5, chaidh staining NCC fhaicinn ann am filleadh neural seòrsa fiadhaich (NF) agus earrannan mutant.Nochd co-staining de SOX10 agus β-catenin ann an E8.5 WT (K) agus mutant (L) barrachd staining β-catenin aig crìochan cealla anns na pìosan neural.Aig E9.5, chaidh staining seòrsa fiadhaich de CNCCn imrich (M, O, Q) fhaicinn, agus ann am mutants, bha CNCCn neo-shrathaichte a’ dathadh pasgain neural fosgailte (N, P, R).(S-Z) Mion-sgrùdadh labeling in vivo AJ ann an earrannan coronal de embryons WT agus Specc11DTM096 / RRH048 leis a’ ghluasad E9.5.Tha plèana earrannach tuairmseach air a shealltainn anns an oisean gu h-àrd air an làimh dheis.Ann an earrannan de fhigheagan mutant, chaidh barrachd staining de F-actin (S, T) agus myosin IIb (U, V) fhaicinn.Coltach ris na toraidhean in vitro ann am Fig. 3, ann an embryos mutant, chaidh staining membran leasaichte airson β-catenin (W, X) agus E-cadherin (Y, Z) fhaicinn.(AA-BB) Tha meanbh-dhealbh dealanach de earrann de embryo seòrsa fiadhaich a 'coimhead nas fhaide na crìoch a' chill apical-basal a 'sealltainn roinn shònraichte de dhlùth-dealanach a tha a' nochdadh cinn-rathaid gluasaid (AA, saighdean).An coimeas ri sin, ann an earrannan de embryons mutant Specc11 (BB, saighdean), tha an snaim apicobasal gu lèir dlùth le dealan, a’ nochdadh dùmhlachd nas motha agus sgapadh de chinn-rathaid adhesive.
Gus deuchainn a dhèanamh air a’ bheachd-bharail againn gu bheil lughdachadh lughdachadh mar thoradh air AJ atharraichte, rinn sinn sgrùdadh air bileagan AJ ann am pasganan neural fosgailte de embryons mutant Specc1l (Fig. 5S-Z).Chunnaic sinn àrdachadh ann an snàithleach cuideam actin (Fig. 5S, T) agus barrachd sgìreachadh de staining myosin IIB air snàithleach actin (Fig. 5U, V).Gu cudromach, chunnaic sinn barrachd staining de β-catenin (Fig. 5W, X) agus E-cadherin (Fig. 5Y,Z) aig crìochan eadar-cheallach.Rinn sinn sgrùdadh cuideachd air staining β-catenin de NCC ann am pasgan neural de embryos E8.5 (Fig. 5K, L).Bha coltas gu robh staining β-catenin nas làidire ann am pasganan neònach mutant Specc1l (Fig. 5L agus K), a 'moladh gun robh atharrachaidhean AJ air tòiseachadh.Ann am meanbh-dhealbhan dealanach de earrannan claigeann de embryos E9.5, chunnaic sinn a-rithist barrachd staining dùmhail dealanach ann an embryos mutant Specc1l an taca ri WT (Fig. 5AA, BB agus S1E-H).Air an gabhail còmhla, tha na toraidhean sin a’ toirt taic do na toraidhean in vitro againn ann an ceallan SPECC1L-kd U2OS agus a’ moladh gu bheil staining AJ aberrant a’ tighinn ro shreath CNCC anns na embryons mutant againn.
Leis an dàimh antagonistic aithnichte eadar gnìomhachd AKT agus seasmhachd E-cadherin, 17,28 smaoinich sinn gu robh comharran PI3K-AKT an sàs.A bharrachd air an sin, chunnaic sinn sèididh subepidermal ann an cuid de na h-inntinnean mutant againn a fhuair às bho bhàsmhorachd (<5%) aig E9.5-10.5 agus an àite sin shocraich sinn timcheall air E13.5 (Fig. S3).Tha bileagan subepidermal mar chomharradh air comharran PI3K-AKT lùghdaichte stèidhichte air PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) aithris gu bheil aimhreit ann an gnìomhachd PI3K stèidhichte air PDGFRα ann an embryons mutant PdgfraPI3K / PI3K a’ leantainn gu bileagan subepidermal, lochdan tiùba neural, agus phenotypes palate cleft.Gu dearbha, chaidh ìrean de pan-AKT agus gnìomhach phosphorylated Ser473-AKT a lùghdachadh ann an vivo ann an clò Specc1l mutant gu E9.5 grèim embryonach (Fig. 6A-D).Dh'fhaodadh an lùghdachadh ann an ìrean de phosphorylated Ser473-AKT a bhith gu tur mar thoradh air an lùghdachadh ann an ìrean pan-AKT in vivo (FIG. 6E) agus in vitro (FIG. 6F).Cha deach lùghdachadh in vitro fhaicinn ach nuair a bha ceallan U2OS gu math dlùth le atharrachaidhean ann an cumadh cealla agus dùmhlachd AJ (Figear 6D).Mar sin, tha an dàta againn a’ nochdadh gu bheil SPECC1L na riaghlaiche adhartach ùr air comharran PI3K-AKT ann am morphogenesis craniofacial.
(A-E) E8.5 (A, B) agus E9.5 (C, D) earrannan claigeann no E9.5 lysates bho Specc1l mutant embryons (E) a 'sealltainn ìrean de gnìomhach phosphorylated S473-AKT agus pan-AKT lùghdachadh pròtain , an coimeas ri smachd WT.Chaidh blotadh an iar a dhèanamh air lysates seòrsa fiadhaich agus lysates mutant fo na h-aon chumhachan.Chaidh na h-ìomhaighean a chaidh a shealltainn airson SPECC1L a thoirt bho aon bhloc.Chaidh an aon blot a thoirt air falbh agus ath-sgrùdadh le antibodies anti-pan-ACT agus β-actin.Chaidh ìrean pan-AKT ann am pasgain neural E8.5 (A, B) agus ìrean de S473-AKT fosphorylated ann an earrannan claigeann E9.5 a lughdachadh gu mòr.(F) Chaidh ìrean Pan-AKT a lughdachadh san aon dòigh ann an lysates de cheallan SPECC1L-kd U2OS air am buain aig comar àrd.Tha bàraichean mearachd a’ riochdachadh SEMn bho thrì tomhasan blot Western neo-eisimeileach.(GJ) Bidh earrannan de embryos WT aig E9.5 air an dath le KI67 agus caspase cleaved 3, fa leth, a’ sealltainn iomadachadh cealla (G, G’) agus glè bheag de ghnìomhachd apoptotic (H, H’).Tha embryons mutant Specc11 a’ nochdadh iomadachadh cealla coimeasach (I), ach tha an àireamh de cheallan a tha fo apoptosis air àrdachadh gu mòr (J).
Rinn sinn sgrùdadh an uairsin air comharran iomadachadh agus apoptosis.Cha do choimhead sinn eadar-dhealachadh sam bith ann an iomadachadh embryos E9.5 (Fig. 6E, G an coimeas ri I) le clàr-amais iomadachaidh de 82.5% airson mutants WT agus 86.5% airson mutants Specc1l air a thomhas le staining KI67 (p <0.56, Fisher's dearbh deuchainn).San aon dòigh, cha do choimhead sinn eadar-dhealachadh sam bith ann an apoptosis air a thomhas le bhith a’ staining airson caspase cleaved 3 ann am pasgain neural aig E8.5 gus an tèid embryo a chur an grèim (gun a shealltainn) (chan eil e ri fhaicinn).An coimeas ri sin, chaidh apoptosis àrdachadh gu mòr anns a h-uile embryo mutant E9.5 (Fig. 6F, H agus J).Tha an àrdachadh iomlan seo ann an apoptosis co-chòrdail ri comharran nas lugha de PI3K-AKT agus bàsmhorachd tràth29,30,31.
An uairsin, gus àite adhbharach a dhearbhadh airson comharran PI3K-AKT ann an atharrachaidhean AJ anns na ceallan kd againn, dh’ atharraich sinn gu ceimigeach an t-slighe ann an ceallan smachd agus kd (Figear 7A-F).Chleachd sinn mar chomharradh an phenotype atharrachadh cumadh cealla a chaidh fhaicinn ann an ceallan SPECC1L-kd confluent, a rinn sinn tomhas a’ cleachdadh a ’cho-mheas den taobh as fhaide (fad) ris an taobh dhìreach fhreagarrach (leud).Tha dùil ri co-mheas de 1 airson ceallan caran cruinn no ciùbach (Figear 7G).A bharrachd air cumadh cealla, dhearbh sinn cuideachd a 'bhuaidh air AJ le staining β-catenin (Fig. 7A'-F').Bha casg air slighe PI3K-AKT a’ cleachdadh wortmannin gu leòr gus cumadh cealla atharrachadh ann an ceallan smachd (Figear 7A, C) agus AJ (Figear 7A’).Cha do chuir PI3K-AKT activator SC-79 buaidh air cumadh cealla (FIG. 7A, E) no leudachadh AJ (FIG. 7A ') ann an ceallan smachd.Ann an ceallan SPECC1L-kd, dh'adhbhraich tuilleadh casg air slighe PI3K-AKT barrachd apoptosis (Fig. 7B, D) agus àrdachadh comharraichte ann an staining β-catenin (Fig. 7B'), co-chòrdail ris na mutants trom in vivo againn.Gu cudromach, chuir gnìomhachd slighe PI3K-AKT gu mòr ri cumadh cealla (Figear 7B, F) agus phenotypes AJ (Figear 7B ”).Chaidh atharrachaidhean ann an cumadh cealla a thomhas mar cho-mheas cruinn cealla (CCR) agus an coimeas airson cudromachd mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd (FIG. 7G).Gu dearbha, ann an ceallan smachd (Fig. 7G, CCR = 1.56), bha làimhseachadh wortmannin gu leòr gus cruth cealla atharrachadh gu mòr (Fig. 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) chun na h-ìre coltach ris an fhear a chaidh fhaicinn ann an SPECC1L.-kd ceallan (Fig. 7G, CCR = 3.46).Cha robh làimhseachadh Wortmannin air ceallan SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 3.60, glè bheag) nas cudromaiche na ceallan kd gun làimhseachadh (Fig. 7G, CCR = 3.46, glè bheag) no ceallan smachd le làimhseachadh wortmann (Fig. 7G)., CCR = 3.46, glè bheag) a’ toirt buaidh cuideachd air leudachadh cealla (7G, CCR = 3.61, glè bheag).Nas cudromaiche, thug gnìomhaiche SC-79 AKT ath-nuadhachadh air an phenotype fada de cheallan SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Tha na toraidhean sin a’ dearbhadh gu bheil SPECC1L a’ riaghladh comharran PI3K-AKT agus a’ moladh gu bheil lùghdachadh meadhanach ann an SPECC1L a’ toirt buaidh air adhesion cealla, fhad ‘s a tha lùghdachadh làidir a’ leantainn gu apoptosis (Fig. 8).
(A-F') Smachd (A, C, E) agus SPECC1L-kd (B, D, F) ceallan air an làimhseachadh le làimhseachadh bacadh slighe PI3K-AKT wortmannin (C, D) no SC-79 activator (E, F) Tha ceallan smachd neo-làimhseachadh ciùbach (A) le staining cealla β-cat àbhaisteach (A '), fhad' sa tha ceallan kd nas fhaide (B) le barrachd staining β-cat (B ').Às deidh an t-slighe PI3K-AKT a chuir dheth, chaidh ceallan smachd a leudachadh (C) le leudachadh β-cat (C’), fhad ‘s a thòisich ceallan kd a’ dol tro apoptosis (D), coltach ris na h-embryons fìor mutated againn agus a ’sealltainn β-cat air leth leasaichte.staining (D').Às deidh an t-slighe PI3K-AKT a chuir an gnìomh, dh’ fhan ceallan smachd ciùbach (E) agus bha staining β-cat (E’) àbhaisteach aca, fhad ‘s a bha ceallan kd a’ nochdadh cumadh cealla mòran nas fheàrr (F) agus staining β-cat (F ’), a’ nochdadh (G) Chaidh an ìre de dh’ atharrachadh cumadh cealla ann an (AF) a thomhas a ’cleachdadh a’ cho-mheas cruinn cealla (CCR) den taobh as fhaide (fad) agus an tomhas dìreach co-fhreagarrach (leud) a ’cleachdadh bathar-bog MetaMorph.Gun làimhseachadh (NT) bha ceallan SPECC1L-kd (CCR = 3.46) gu math nas fhaide na ceallan smachd (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).Bha casg Wort air an t-slighe PI3K-AKT ann an ceallan smachd gu leòr gus leudachadh coltach ris a dhèanamh ann an cumadh cealla (CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9).San aon dòigh, chuir gnìomhachd AKT le SC-79 ann an ceallan SPECC1L-kd air ais leudachadh cealla gu ìrean smachd (CCR = 1.74, p <6.2 × 10–12).Mar thoradh air làimhseachadh Wortmannin de cheallan SPECC1L-kd thàinig barrachd apoptosis ach cha deach àrdachadh sam bith eile ann an atharrachadh cumadh cealla (CCR = 3.60) an coimeas ri kd gun làimhseachadh (CCR = 3.46, ns) no ceallan smachd le làimhseachadh wortmann (3.61) a chaidh fhaicinn ann an .ns = chan eil e gu diofar.+/- Tha tomhasan SEM airson 50 cealla air an sealltainn.Chaidh eadar-dhealachaidhean staitistigeil a thomhas a’ cleachdadh deuchainn-t nan Oileanach.
(A) Riochdachadh sgeamaigeach de chasg agus gnìomhachadh slighe PI3K-AKT a ’leantainn gu atharrachaidhean AJ agus teasairginn, fa leth.(B) Modail air a mholadh airson seasmhachd pròtain AKT le SPECC1L.
Feumaidh CNCCan ro-imrich AJ lysis dealachadh bho cheallan neuroepithelial fillte neural roimhe1,15,32.Tha barrachd staining de cho-phàirtean AJ agus call cuairteachadh neo-chunbhalach AJ apical-basal ann an ceallan easbhaidheach SPECC1L an dà chuid in vitro agus in vivo, còmhla ri cho faisg ‘s a tha SPECC1L gu β-catenin, a’ moladh gu bheil SPECC1L ag obair gus seasmhachd ionadail AJ a chumail suas gu ceart airson fèithean eagrachaidh.actin cytoskeleton.Tha an ceangal eadar SPECC1L leis an actin cytoskeleton agus β-catenin agus an àrdachadh anns an àireamh de fhilamentan actin co-dhlùthaichte às aonais SPECC1L co-chòrdail ris an àrdachadh a chaidh fhaicinn ann an dùmhlachd AJ.Is e comas eile a th’ ann gu bheil àireamh nas motha de shnàithleach actin ann an ceallan le dìth SPECC1L a’ leantainn gu atharrachadh ann an teannachadh eadar-cheallach.Leis gu bheil cuideam ceallach a’ toirt buaidh air daineamaigs AJ 33, faodaidh atharrachaidhean bholtachd leantainn gu AJ 34 nas sgaoilte.Mar sin bheir atharrachaidhean sam bith buaidh air na sreathan CNCC.
Tha Wnt1 air a chuir an cèill anns na pìosan neòil tràth a dh’ adhbhraicheas ceallan suaicheantas neural.Mar sin, tha lorg loidhne Wnt1-cre a’ comharrachadh an dà chuid ro agus imrich NCC35.Ach, tha Wnt1 cuideachd a’ comharrachadh clones clò eanchainn droma cuideachd a thàinig bho fhilltean neural tràth 35,36, ga fhàgail dualtach nach e CNCC a th’ ann an staining mutants E9.5 airson comharran Wnt1 ann am pasganan neural fosgailte.Dhearbh an dath adhartach a th’ againn airson comharran NCC AP2A agus SOX10 gun robh CNCC gu dearbh anns na pasgain neural fosgailte de embryons mutant Specc11.A bharrachd air an sin, leis gu bheil AP2A agus SOX10 nan comharran air imrich tràth NCC, chomharraich staining dearbhach gur e CNCC iar-imrich a th’ anns na ceallan sin nach urrainn a bhith air an sàrachadh le E9.5.
Tha an dàta againn a’ nochdadh gu bheil riaghladh moileciuil AJ le SPECC1L air a mheadhanachadh le comharran PI3K-AKT.Tha comharran AKT air a lughdachadh ann an ceallan agus maothran easbhaidheach SPECC1L.Co-dhùnaidhean Fantauzzo et al.cuir taic ri dreuchd dhìreach airson comharran PI3K-AKT ann am morphogenesis craniofacial.(2014) gu bheil dìth gnìomhachd comharran PI3K-AKT stèidhichte air PDGFRα a’ leantainn gu phenotype palate cleft.Bidh sinn cuideachd a’ sealltainn gu bheil casg air slighe PI3K-AKT gu leòr gus cruth AJ agus cealla atharrachadh ann an ceallan U2OS.A rèir ar co-dhùnaidhean, Cain et al.Sheall 37 gu bheil ìsleachadh air an fho-aonad PI3K α110 ann an ceallan endothelial a’ leantainn gu àrdachadh co-chosmhail ann an staining pericellular β-catenin, ris an canar àrdachadh anns an “clàr-amais ceangail”.Ach, ann an ceallan endothelial aig a bheil filamentan actin air an deagh eagrachadh mar-thà, bidh casg air slighe PI3K-AKT a’ leantainn gu cumadh cealla sgaoilte.An coimeas ri sin, sheall ceallan SPECC1L-kd U2OS cumadh cealla fada.Faodaidh an t-eadar-dhealachadh seo a bhith sònraichte do sheòrsa cealla.Fhad ‘s a tha casg air comharran PI3K-AKT a’ toirt buaidh mhaireannach air an actin cytoskeleton, tha a’ bhuaidh air cumadh cealla air a dhearbhadh le atharrachaidhean ann an teannachadh air adhbhrachadh le atharrachaidhean ann an dùmhlachd agus eagrachadh snàithleach actin sa mheadhan.Ann an ceallan U2OS, cha do chleachd sinn ach atharrachaidhean cumadh cealla mar chomharradh air atharrachadh agus ath-bheothachadh AJ easbhaidheach SPECC1L.Ann an co-dhùnadh, tha sinn a’ gabhail beachd gu bheil casg air slighe AKT ann an easbhaidh SPECC1L ag àrdachadh seasmhachd AJ agus a’ lughdachadh delamination ann an CNCC.
Gu inntinneach, chaidh ìrean pan-AKT a lughdachadh ann an vitro agus in vivo a bharrachd air ìrean fosphorylated 473-AKT às aonais SPECC1L, a ’moladh riaghladh comharran PI3K-AKT aig ìre seasmhachd pròtain AKT no tionndadh.Bidh na ginean SPECC1L agus MID1, an dà chuid co-cheangailte ri syndrome Opitz / GBBB, a’ còdachadh phròtainean a bhios a’ bunailteachadh microtubules 18,22 .Chan eilear a’ tuigsinn gu h-iomlan an dòigh anns am bi seasmhachd microtubule meadhanach SPECC1L agus MID1.A thaobh SPECC1L, tha an seasmhachd seo a’ toirt a-steach acetylation leasaichte de fo-sheata de microtubules 18 .Tha e comasach gun cleachd SPECC1L dòigh coltach ris gus pròtanan eile leithid AKT a dhèanamh seasmhach.Thathas air sealltainn gu bheil acetylation fuigheall lysine ann am pròtain AKT a’ leantainn gu lùghdachadh ann an sgìreachadh membran agus fosphorylation38.A bharrachd air an sin, tha feum air ubiquitination den t-sreath K63 aig an aon fhuigheall lysine air AKT airson a bhith ag àiteachadh membran agus a chuir an gnìomh39,40.Am measg grunn fhactaran a tha ag eadar-obrachadh le pròtanan SPECC1L a chaidh an comharrachadh ann an grunn scrionaichean dà-chinealach giosta le cuir a-steach àrd, tha ceithir - CCDC841, ECM2942, APC agus UBE2I43 - air a bhith an sàs ann an tionndadh pròtain no seasmhachd tro ubiquitination no sumoylation.Faodaidh SPECC1L a bhith an sàs ann an atharrachadh iar-eadar-theangachaidh air fuigheall lysine AKT, a’ toirt buaidh air seasmhachd AKT.Ach, tha àite deatamach SPECC1L ann an sgìreachadh agus seasmhachd pròtain AKT fhathast ri shoilleireachadh.
Mar thoradh air fìor lochdan ann an abairt SPECC1L in vivo chaidh barrachd staining comharra AJ agus ath-chòmhdach CNCC easbhaidheach, a bharrachd air barrachd apoptosis agus bàsmhorachd tràth.Tha aithisgean roimhe seo air sealltainn gu bheil mutants luchag le ìrean nas àirde de apoptosis co-cheangailte ri lochdan tiùb neòil 44,45,46,47 agus lochdan craniofacial48.Chaidh a mholadh gum faodadh cus bàs cealla anns na pìosan neural no boghan pharyngeal leantainn gu àireamh gu leòr de cheallan a tha riatanach airson gluasad morphogenetic ceart 48,49,50.An coimeas ri sin, cha do sheall na loidhnichean cealla easbhaidheach SPECC1L againn le abairt SPECC1L meadhanach nas lugha ach atharrachaidhean AJ às aonais fianais de bhàs cealla nas motha.Ach, dh'adhbhraich casg ceimigeach air an t-slighe PI3K-AKT anns na ceallan Kd sin barrachd apoptosis.Mar sin, tha lùghdachadh meadhanach ann an abairt no gnìomh SPECC1L a’ dèanamh cinnteach gum mair cill beò.Tha seo co-chòrdail ris an amharc gu bheil embryons mutant Specc11 tearc a tha a’ teicheadh ​​​​bho chur an grèim aig st.E9.5 - 's dòcha mar thoradh air èifeachdas glacaidh gine nas lugha - comasach air na tiùban neònach aca a dhùnadh agus stad nas fhaide air adhart ann an leasachadh, gu tric le uireasbhaidhean craniofacial (Fig. S3).Cuideachd co-chòrdail ri seo tha an tachartas tearc de embryos heterozygous Specc1l le ana-cainnt craniofacial - is dòcha mar thoradh air barrachd èifeachd glacaidh gine - a bharrachd air an lorg ann an zebrafish anns a bheil aon den dà orthologues SPECC1L (specc1lb) ag adhbhrachadh phenotypes embryonic fadalach, a’ toirt a-steach call giallan ìseal agus sgoltagan dà-thaobhach51.Mar sin, dh’ fhaodadh mùthaidhean call-gnìomh heterozygous SPECC1L a chaidh an comharrachadh ann an euslaintich daonna uireasbhaidhean beaga adhbhrachadh ann an gnìomh SPECC1L rè morphogenesis craniofacial, gu leòr airson na sgoltagan orofacial aca a mhìneachadh.Faodaidh riaghladh stèidhichte air SPECC1L de cheangalaichean eadar-cheallach pàirt a ghabhail ann am palatogenesis agus cothlamadh nam boghachan pharyngeal.Cuidichidh tuilleadh sgrùdaidhean air gnìomh SPECC1L le bhith a’ soilleireachadh àite luchd-ceangail sealach eadar ceallach ann an CNCC aig àm dùnadh tiùb neòil ann an motility cealla neuroepithelial agus morphogenesis craniofacial.
Chaidh iomradh a thoirt air smachd osteosarcoma U2OS agus ceallan SPECC1L-kd roimhe seo (Saadi et al., 2011).Tha antibodies an aghaidh SPECC1L cuideachd air an comharrachadh roimhe seo (Saadi et al., 2011).Antibodies anti-β-catenin (coineanach; 1: 1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (luchag; 1: 1000; Teicneòlas Comharran cealla, Danvers, MA), myosin IIb (1: 1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ), MO) ), E-cadherin (1: 1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1: 1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1: 1000; 1000; Bith-eòlas Siostaman Aviva, San Diego , California), DLX2 (1: 1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1: 1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1: 1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) ), KI67 (1: 1000; Teicneòlas comharran cealla, Danvers, MA), caspase 3 (1: 1000; Teicneòlas Comharran cealla, Danvers, MA) agus β-actin (1: 2500; Sigma-Aldrich, St. Louis,) MO) air a chleachdadh mar a chaidh a mhìneachadh..Chaidh filamentan actin a dhath le Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Bha ceallan smachd U2OS agus ceallan SPECC1L-kd air an àiteachadh ann an DMEM àrd-ghlùcois àbhaisteach le taic bho serum bò fetal 10% (Life Technologies, Carlsbad, CA).Airson atharrachaidhean AJ, chaidh ceallan 2 x 105 a shìolachadh air glainne air an làimhseachadh le gelatin porcine 0.1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) agus chaidh fhaicinn airson atharrachaidhean ann an cumadh cealla.Chaidh ceallan a chruinneachadh aig diofar amannan comharraichte: 4 uairean às deidh sìolachadh (t = 1), 24 uairean às deidh sìolachadh (t = 2), comar gun atharrachadh ann an cumadh cealla (t = 3), atharrachadh ann an cumadh cealla (t = 4) , 24 h às deidh atharrachadh cumadh cealla (t = 5) agus 48 h às deidh atharrachadh cumadh cealla (t = 6) (Fig. 1, 2, 3).Gus an t-slighe PI3K-AKT atharrachadh, bha ceallan air an àiteachadh aig na co-chruinneachaidhean ainmichte leis an inhibitor PI3K-AKT wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) no SC-79 activator (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Bha am meadhan anns a bheil na ceimigean air atharrachadh gach latha.
Chaidh clàraidhean frèam-air-frèam a dhèanamh air smachd beò agus ceallan KD fo chumhachan cultair àbhaisteach, agus chaidh ìomhaighean iomsgaradh ìre a chruinneachadh a h-uile 10 mionaidean airson 7 latha.Chaidh dealbhan fhaighinn le bhith a’ cleachdadh miocroscop inverted Leica DM IRB fo smachd coimpiutair uidheamaichte le ìre meacanaigeach agus amas 10 × N-PLAN ceangailte ri camara QImaging Retiga-SRV.Rè ìomhaighean, chaidh cultaran cealla a chumail aig 37 ° C ann an àile tais le 5% CO2.
Chaidh dà loidhne cealla ES ribe gine DTM096 agus RRH048 bhon Ionad Ghoireasan Mutant Luch Roinneil (UC Davis, CA) a chleachdadh gus loidhnichean luchag easbhaidheach Specc11 a ghineadh, ainmichte Specc1lgtDTM096 agus Specc1lgtRRH046.Gu h-aithghearr, chaidh ceallan 129 / REJ ES a chuir a-steach do blastocysts C57BL6.Chaidh na luchagan fireann chimeric a thàinig às a sin a briodadh le luchagan boireann C57BL6 gus clann aithneachadh le dath còta agouti.Chaidh làthaireachd cuir a-steach vector ribe gine a chleachdadh gus heterozygotes aithneachadh.Chaidh luchagan a chumail air cùl measgaichte de 129 / REJ; C57BL6.Chaidh suidheachadh làrach cuir a-steach an vectar ribe ginteil a dhearbhadh le RT-PCR, sreath genome, agus leudachadh ginteil (Figear Leasachail 1).Gus lorg a dhèanamh air loidhne CNCC de luchagan dùbailte heterozygous Specc1lGT, chaidh luchagan ROSAmTmG (# 007576) agus Wnt1-Cre (# 003829) (Jackson Laboratory, Bar Harbour, ME) a ​​thionndadh gus an allele ROSAmTmG agus Wnt1-Cre a thoirt a-mach ann an Specc1l mutant embryos.Chaidh a h-uile deuchainn ann an luchagan a dhèanamh a rèir protocolaidhean a chaidh aontachadh le Comataidh Institiud Cùram is Cleachdadh Bheathaichean aig Ionad Meidigeach Oilthigh Kansas.
Chaidh embryos a shuidheachadh a-steach (1% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) airson 60 min aig teòthachd an t-seòmair.Às deidh socrachadh ann am fuasgladh staining X-gal (5 mM potassium ferricyanide, 5 mM potassium ferrocyanide, 2 mM MgCl2, 0.01% sodium deoxycholate, 0.02% NP-40, 1 mg / ml X-gal) Chaidh leasachadh stain a dhèanamh aig 37 ° C .° C taobh a-staigh 1-6 uairean.Chaidh embryos a shocrachadh ann an 4% PFA agus chaidh am faicinn.
Airson blotting an Iar, chaidh ceallan a chuir ann am bufair lysis fulangach (Promega, Fitchburg, WI) le measgachadh de luchd-dìon protease HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Chaidh Lysates a ghiullachd air gels deiseil 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad, Hercules, CA) agus a ghluasad gu membran Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).Chaidh na buill-bodhaig a bhacadh ann am bainne 5% ann am PBS anns an robh 0.1% Tween.Chaidh antibodies a thoirt a-steach thar oidhche aig 4 ° C no airson uair a thìde aig teòthachd an t-seòmair.Chaidh reactar Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA) a chleachdadh airson gineadh chomharran.Airson dìon dìon, chaidh embryos a shuidheachadh thar oidhche ann an 4% PFA / PBS agus cryopreserved.Chaidh cryosections meiteag a bhacadh ann am PBS anns an robh 1% serum gobhar àbhaisteach (Thermo Scientific, Waltham, MA) agus 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) agus an uairsin air an goir aig 4 ° C ann an goireadair rè an oidhche.le antibody àrd-sgoile an-aghaidh antibody agus fluorescent (1: 1000) airson 1 uair aig 4 ° C.Chaidh earrannan dathte a chuir ann am meadhan òir ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) agus chaidh ìomhaighean còmhnard fhaighinn a’ cleachdadh miocroscop confocal Leica TCS SPE.Chaidh gach immunostaining a dhèanamh mar trì deuchainnean neo-eisimeileach air cuairteachadh co-dhiù dà embryo mutant.Tha deuchainn riochdachail air a thaisbeanadh.
Chaidh ceallan a bhrosnachadh ann am bufair RIPA atharraichte (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glicerol, 2 mM EDTA, agus bacadh protease HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Ann an ùine ghoirid, chaidh lysates ullachadh le grìogagan magnetach pròtain G (Life Technologies, Carlsbad, CA) agus an uairsin air an gortachadh thar oidhche aig 4 ° C. le grìogagan pròtain anti-SPECC1L no IgG pròtain G air an cleachdadh gus SPECC1L a thoirt a-mach agus chaidh blotting an Iar a dhèanamh a’ cleachdadh an anti-SPECC1L no pròtain IgG. -β-catenin antibody air a mhìneachadh gu h-àrd Tha na deuchainnean co-IP a tha air an sealltainn a’ riochdachadh ceithir deuchainnean neo-eisimeileach.
Chaidh ceallan cultarach stèidhichte no nèapraigean luchag a thoirt don ionad microscopy dealanach aig Ionad Meidigeach Oilthigh Kansas.Ann an ùine ghoirid, chaidh sampallan a chuir a-steach ann an roisinn EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polymerized thar oidhche aig 60 ° C, agus air an roinn aig 80 nm a ’cleachdadh ultramicrotome Leica UC7 uidheamaichte le lann daoimean.Chaidh earrannan fhaicinn le bhith a’ cleachdadh miocroscop dealanach tar-chuir JEOL JEM-1400 uidheamaichte le gunna 100 kV Lab6.
Mar a bheir thu luaidh air an artaigil seo: Wilson, NR et al.Tha easbhaidh SPECC1L a’ leantainn gu barrachd seasmhachd ann an joints spliced ​​agus lughdachadh lughdachadh de cheallan suaicheantas neural cranial.an saidheans.6, 17735;doi: 10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Inntrigeadh agus eadar-dhealachadh air an t-suaicheantas neural.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Ceallan suaicheantas cranial neòil a’ gluasad: an àite ann an leasachadh craniofacial.American Journal of Medical Genetics.Pàirt A 155A, 270–279, doi: 10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopia: a fàs agus a leasachadh thar 20 bliadhna.Péidiatraiceach.pathology.obair-lann.leigheas.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU agus Noten MM Briseadh ann an gintinneachd sgoltagan orofacial.Claonaidhean ann an Leigheas Molecular 17, 725–733, doi: 10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. agus Riley, FM Innealan moileciuil airson imrich cealla suaicheantas neural cranial agus pàtrain rè leasachadh craniofacial.Leasachadh 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH agus Murray, JK Cleft lip and palate: a’ tuigsinn buadhan ginteil agus àrainneachdail.beachd nàdarra.Gintinneachd 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Tha Ingram, CR et al.Morphogenesis neo-àbhaisteach den chraiceann, buill-bodhaig, agus roinn craniofacial ann an luchagan easbhaidheach factar-6 (Irf6) a tha a’ riaghladh interferon.Genette Nàiseanta.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Bidh mùthaidhean ceannasach ann an GRHL3 ag adhbhrachadh syndrome van der Waord agus a’ cur bacadh air leasachadh periderm beòil.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ agus Juriloff, DM Ùraich an liosta de mutants luchag le uireasbhaidhean ann an dùnadh tiùb neural agus adhartas a dh’ ionnsaigh tuigse ginteil iomlan mu dhùnadh tiùb neural.Rannsachadh air lochdan breith.Pàirt A, Teratology Clionaigeach agus Molecular 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. Tha comharradh PDGFRalpha le meadhan PI3K a’ riaghladh mairsinn agus iomadachadh ann an leasachadh cnàimhneach tro shlighe intracellular a tha an urra ri p53.Leasachadh gine 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND agus Murdoch, JN Diseveled: Co-cheangailte ri leudachadh co-obrachail ri dùnadh tiùb neònach.Claonaidhean ann an neurology.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).